1、福建農(nóng)林大學(xué)博士學(xué)位論文（木奈）多酚氧化酶基因及5′端調(diào)控序列的克隆姓名：陳桂信申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：果樹學(xué)指導(dǎo)教師：呂柳新潘東明20050401福建農(nóng)林大學(xué)博士學(xué)位論文摘要摘要捺(PrUllUJsalicinaLindlvarcordataJY：ZhangetaL)生產(chǎn)上普遍存在果肉的褐變現(xiàn)象，造成果實(shí)的食用品質(zhì)和耐貯性下降，甚至喪失其商品價(jià)值。耪果肉褐變是多酚類物質(zhì)、多酚氧化酶(polyphenoloxidase，PPO)與氧結(jié)合

2、起酶促反應(yīng)的結(jié)果。本研究采用RTPCR、RACE和染色體步移等分子生物學(xué)技術(shù)，從耪嫩芽和果肉中分離PPO基因及5／端調(diào)控序列，為進(jìn)一步采用反義RNA技術(shù)，進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，解決耪噪肉褐變問題開辟一條新的遺傳改良途徑。主要試驗(yàn)結(jié)果如下：1建立了粽基因組DNA的提取和純化方法為解決櫬組織器官內(nèi)多酚類物質(zhì)、多糖、色素等物質(zhì)的干擾，本試驗(yàn)以捺嫩芽為材料，加入10％(W／W)PVPP與材料充分研磨，提取緩沖液中B巰基乙醇的濃度為1％(vⅣ)；用氯仿／

3、異戊醇(24：1)抽提裂解液2次，在所獲得的上相中，加入1／10體積經(jīng)65℃預(yù)熱的NaCVCTAB溶液，混勻，再用氯仿／異戊醇(24：1)連續(xù)抽提2次；在DNA粗提液中加入2／3體積的5MNaCl和3倍體積冰冷的無水乙醇沉淀DNA。結(jié)果表明，該方法能有效地去除櫬嫩芽中多酚和多糖等雜質(zhì)，所得DNA樣品比較純凈、完整，可以直接用于后續(xù)的PCR擴(kuò)增、酶切和染色體步移。2建立了捺嫩芽總RNA的提取和純化方法。通過加入1004(W／W)PVPP與

4、材料共研磨，并在TriZoL提取液中加入l％(V／V)D一巰基乙醇；在勻漿液中加入終濃度為20％乙醇沉淀多糖：在裂解液抽提的上相中加入終濃度為3MLiCI沉淀RNA；在RNA的粗提液中加入1／30體積的3MNaAc(pH52)和O1倍體積的無水乙醇沉淀多糖。試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法有效地去除了檬嫩芽中多酚、多糖等雜質(zhì)，獲得純凈、完整的RNA樣品，直接用于后續(xù)的RTPCR和RACE反應(yīng)。3建立了糠果肉總RNA提取和純化方法。提取緩沖液中的Tr