1、草地早熟禾(Poa Pratensis L.)是溫帶地區(qū)常用的優(yōu)質(zhì)冷季型草坪草種，是已知的抗寒能力最強(qiáng)的草坪草種之一。植物體內(nèi)存在多條低溫信號(hào)傳遞和調(diào)控途徑，其中,DREB1/CBF調(diào)控途徑被認(rèn)為是植物抵御低溫的主要途徑。DREB1/CBF基因是植物響應(yīng)低溫脅迫的轉(zhuǎn)錄激活因子，它通過調(diào)控下游基因包括冷應(yīng)答基因(COR)的表達(dá)來提高植物的抗寒能力。
　　本研究從抗寒的草地早熟禾中克隆到一個(gè)DREB1/CBF類基因—PpCBF3，通過

2、轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥，旨在快速研究該基因在抗寒性中的作用，為改良冷敏感多年生草坪草種的抗寒性奠定基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)主要研究結(jié)果如下:
　　(1)從低溫處理后的草地早熟禾葉片中分離出一個(gè)開放閱讀框(ORF)全長為732bp，編碼243個(gè)氨基酸的基因。序列分析表明該基因在AP2 DNA結(jié)構(gòu)域的上游和下游分別具有PKK/RPAGRXKFXETRHP和DSAEL這兩段DREB1/CBF轉(zhuǎn)錄因子的特征序列。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，PpCBF3與多年生黑

3、麥草LpCBF3同源性最高，與其他單子葉植物和擬南芥的DREB1/CBF3基因也有很高的同源性，因此認(rèn)為PpCBF是一個(gè)DREB1/CBF轉(zhuǎn)錄因子。
　　(2)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PpCBF3特異地定位于細(xì)胞核中，與基因中具有核定位信號(hào)(NLS)的結(jié)果相符。
　　(3)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)和半定量實(shí)驗(yàn)表明，PpCBF3基因受低溫誘導(dǎo)，低溫處理15min時(shí)PpCBF3已響應(yīng)表達(dá)，1h表達(dá)量最高，24 h后其表達(dá)量

4、仍顯著高于常溫狀態(tài)。在干旱脅迫和高鹽脅迫下，草地早熟禾PpCBF3基因的mRNA相對表達(dá)量并無明顯改變，因此推測PpCBF3不響應(yīng)干旱脅迫(20％ PEG-6000)和鹽脅迫(150 mM NaCl)。
　　(4)通過農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥，通過雙丙胺膦(Basta)篩選和PCR鑒定，得到12個(gè)陽性轉(zhuǎn)基因株系。對其進(jìn)行冷凍(-20℃)處理，并根據(jù)葉片枯黃率的結(jié)果篩選出5個(gè)穩(wěn)定的抗性轉(zhuǎn)基因株系，即line3，line6，line9，

5、line11和line12。mRNA相對定量表達(dá)分析和western印運(yùn)分析表明，轉(zhuǎn)基因株系的PpCBF3都能夠在常溫下穩(wěn)定表達(dá)。
　　(5)在常溫下，轉(zhuǎn)基因擬南芥中DREB1/CBF下游基因COR15a，COR6.6/KIN2，COR47和COR78/RD29a和脯氨酸合成的關(guān)鍵酶基因P5CS的相對表達(dá)量都顯著高于WT植株。而在低溫處理后，盡管WT中這些基因的表達(dá)量提高，轉(zhuǎn)基因株系中這些基因的表達(dá)量仍然顯著高于WT。另外，在冰凍

6、處理后，轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片相對電導(dǎo)率，F(xiàn)v/Fm值和葉綠素含量都顯著高于WT; DAB染色和NBT染色結(jié)果顯示，WT擬南芥在低溫脅迫下的H2O2和O2·-含量更高。
　　(6)轉(zhuǎn)基因擬南芥普遍出現(xiàn)開花推遲、矮化或生長延緩等特性，這些特性對多年生草坪草種的基因改良有著極大的意義。
　　綜上所述，從草地早熟禾中克隆到轉(zhuǎn)錄因子PpCBF3，它特異受低溫誘導(dǎo)，對干旱脅迫和鹽脅迫沒有響應(yīng)。通過轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥，初步確定該基因通過對下游