1、在蛋白質合成的過程中，當三個終止密碼子UAA、UAG或UGA中的任意一個出現時，蛋白質合成即終止。終止密碼子是由第一類肽鏈釋放因子識別的。在真核生物中，eRF1可以識別三個終止密碼子，并催化新生肽鏈與位于核糖體P-位點的tRNA之間的酯鍵水解，釋放新生肽鏈。隨后，eRF3促使eRF1從核糖體上脫離。
　　絕大多數真核生物只有一種第一類肽鏈釋放因子eRF1，真核生物的eRF1在蛋白質一級結構上極為相似，人的第一類肽鏈釋放因子eRF1

2、在晶體結構和溶液中都包含三個結構域（N，M和C結構域）。N結構域在核糖體A位點識別終止密碼子，M結構域與肽酰轉移酶中心相互作用，通過高度保守的GGQ模塊對肽酰-tRNA的酯鍵進行親核進攻，使酯鍵水解釋放新生肽鏈，C結構域則是與第二類肽鏈釋放因子eRF3結合的主要區(qū)域。兩類肽鏈釋放因子都是終止過程中的關鍵因子，在終止密碼子的識別過程中eRF3與eRF1耦合成為翻譯過程的校讀因子，并有效地完成新生肽鏈的釋放過程。
　　有些生物偏離了遺

3、傳密碼體系稱為遺傳密碼變異生物（variant code organisms），例如:纖毛蟲中的游仆蟲和赭纖蟲都是遺傳密碼發(fā)生變異的生物，使用UAA和UAG作為終止密碼子，而將UGA重新解碼為有義密碼子，UGA在八肋游仆蟲（Euplotesoctocarinatus）中被重新解碼為半胱氨酸，而在日本赭纖蟲(Blepharisma japonicum)中UGA則被重新解碼為色氨酸。遺傳密碼變異生物的eRF1與標準遺傳編碼生物(standa

4、rd code organisms)的eRF1高度同源，而局部的不同可能正是導致功能差異的原因。這些在標準遺傳編碼生物中高度保守，而在遺傳密碼變異生物中保守性降低的模體可能正是密碼子識別的關鍵位點。
　　與大多數真核生物不同，八肋游仆蟲中有兩種第一類肽鏈釋放因子，分別為Eo-eRF1a和Eo-eRF1b。Eo-eRF1b基因的閱讀框中有三個終止密碼子UGA，將其突變?yōu)橛辛x密碼子才能在體外表達。本研究將Eo-eRF1b基因閱讀框中的

5、三個終止密碼子UGA突變?yōu)榘腚装彼崦艽a子，并分別對八肋游仆蟲第一類肽鏈釋放因子（Eo-eRF1a和Eo-eRF1b）以及日本赭纖蟲第一類肽鏈釋放因子(Bj-eRF1)的N、C結構域及全長蛋白進行了克隆、表達、純化和鑒定。Eo-eRF3Cm6為八肋游仆蟲第二類肽鏈釋放因子Eo-eRF3的一種截短肽，本課題組前期工作已證明Eo-eRF3Cm6是八肋游仆蟲第二類肽鏈釋放因子Eo-eRF3與八肋游仆蟲第一類肽鏈釋放因子Eo-eRF1a相互作用的

6、最短肽，本研究利用體外pulldown實驗證明兩種纖毛蟲第一類肽鏈釋放因子及其C結構域都可以與Eo-eRF3Cm6結合形成復合物。
　　大多數蛋白都有發(fā)色基團，蛋白質內源熒光光譜的變化可以反映蛋白質構象的變化。本研究中的兩種纖毛蟲第一類肽鏈釋放因子（Bj-eRF1、Eo-eRF1a和Eo-eRF1b）的N、C結構域上各含有一個高度保守的色氨酸，熒光光譜結果表明，N結構域上的色氨酸所處的微環(huán)境較為親水，而C結構域上的色氨酸所處的微環(huán)

7、境較為疏水。當與Eo-eRF3Cm6結合形成復合物， Eo-eRF1a、Eo-eRF1b和Bj-eRF1的最大發(fā)射波長發(fā)生藍移（從340 nm藍移到330 nm），表明第一類肽鏈釋放因子的構象發(fā)生了變化。eRF1-eRF3相互作用的部位在eRF1C結構域上，Eo-eRF3Cm6與eRF1的C結構域結合后，Eo-eRF1 a、Eo-eRF1b和Bj-eRF1的C結構域的最大發(fā)射波長沒有發(fā)生藍移。通過對熒光淬滅光譜的分析，結果表明:與Eo-

8、eRF3Cm6結合以后，eRF1及其C結構域的淬滅常數和可淬滅分數都有不同程度的降低，表明其上色氨酸的微環(huán)境轉為疏水。實驗結果說明，與Eo-eRF3Cm6結合后，eRF1最大發(fā)射波長發(fā)生藍移是由于eRF1上N、C結構域之間發(fā)生了相互作用。
　　為了更深入地對eRF1-eRF3相互作用進行分析，我們對八肋游仆蟲第一類肽鏈釋放因子（Eo-eRF1a和Eo-eRF1b）以及日本赭纖蟲第一類肽鏈釋放因子(Bj-eRF1)的N、C結構域進行

9、了基于同源建模的計算機模擬分析并對C結構域上與eRF1-eRF3相互作用的可能位點進行實驗驗證。
　　對C結構域的模擬表明，Eo-eRF1a/bC結構域上高度保守的位點I290和D293（Bj-eRF1中為V294和D297）以及高度保守的GVEDT和GFGG模體直接參與eRF1-eRF3相互作用。本實驗通過對eRF1上保守位點進行定點突變，用Eo-eRF3Cm6誘餌蛋白與突變蛋白進行體外pulldown和Western blot

10、ting檢測，實驗結果可以評估突變位點對eRF1-eRF3相互作用的貢獻，以及發(fā)生作用的主要方式。Bj-eRF1中的V294在其他物種中為Ile，當把V294回復突變?yōu)镮le，對Bj-eRF1與Eo-eRF3Cm6的相互作用影響不大，但是當該位點突變?yōu)锳la，Bj-eRF1、Eo-eRF1a和Eo-eRF1b與Eo-eRF3Cm6的結合能力都大為下降。因此Eo-eRF1 a/bC結構域上I290(Bj-eRF1中為V294)是eRF1C

11、與Eo-eRF3Cm6相互作用的關鍵位點，該位點上側鏈殘基的位阻作用對復合物的穩(wěn)定是十分重要的。另一個保守位點是Asp（Eo-eRF1a/b中為D293，Bj-eRF1中為D297），計算機模擬的結果表明，在三個eRF1C/Eo-eRF3Cm6復合物中，Asp都是形成氫鍵的位點。對這個保守位點的定點突變表明，在復合物Eo-eRF1bC/Eo-eRF3Cm6以及Bj-eRF1C/Eo-eRF3Cm6中，保守位點D293上靜電相互作用和氫鍵

12、締合對形成復合物的影響較大。但在Eo-eRF1 aC/Eo-eRF3 Cm6的復合物中，且該位點上靜電相互作用與氫鍵締合作用對形成復合物的影響比較小。當將這一位點突變?yōu)锳la時，突變蛋白與Eo-eRF3Cm6的結合能力也大大降低。此外，對模擬結果中Eo-eRF1a、Eo-eRF1b和Bj-eRF1的C結構域與Eo-eRF3Cm6相結合前后的體系的總靜電相互作用能和非鍵相互作用能的變化進行分析，結果表明Eo-eRF1 a/Eo-eRF3C

13、m6復合物中靜電相互作用能比Eo-eRF1bC/Eo-eRF3Cm6復合物和Bj-eRF1C/Eo-eRF3 Cm6復合物中靜電相互作用能大。在不同的鹽濃度下對復合物進行共振光散射光譜研究，結果表明Eo-eRF1a/Eo-eRF3Cm6復合物對鹽濃度更為敏感。從上面的結果可以看出，在與Eo-eRF3Cm6相互作用的過程中Eo-eRF1b和Bj-eRF1C結構域的行為比較接近，而Eo-eRF1 aC結構域則與前兩者存在差異，表明在與Eo-

14、eRF3Cm6相互作用的過程中Eo-eRF1a可能選擇了不同于Eo-eRF1b的方式。
　　對eRF1 N結構域突變體的構象進行模擬，并結合其生物功能的變化對eRF1 N結構域識別密碼子的功能進行分析。盡管突變位點的靜電作用能和氫鍵發(fā)生了明顯的變化，但是與eRF1識別密碼子功能的回復并沒有明顯的相關性。值得注意的是在TASNIKS模塊和eRF1C結構域之間有一個構象靈活的loop(95-103)，推測這個loop可能與密碼子的識別