1、第一部分特異性HBV CccDNA功能化納米顆粒制備與鑒定
　　目的:制備特異性富集分離CcDNA功能化的磁性納米顆粒，為建立磁性捕獲雜交方法奠定基礎(chǔ)。
　　方法:通過(guò)化學(xué)共沉淀法制備Fe3O4納米粒子，用“溶膠”法對(duì)納米顆粒進(jìn)行二氧化硅包殼。在納米顆粒表面用鏈霉親和素修飾，利用鏈霉親和素與生物素的親和作用，將鏈霉親和素修飾的納米顆粒與生物素標(biāo)記的CcDNA特異性探針進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，制備CccDNA功能化納米顆粒，最后用FIT

2、C標(biāo)記、與納米顆粒探針完全互補(bǔ)的序列與功能化納顆粒反應(yīng)，確定CccDNA功能化納顆粒米的特性。
　　結(jié)果:
　　(1)合成的Fe3O4納米粒子近似球形，粒度分布較均勻，大小在8-25 nm(平均粒徑為13.2 nm)，粒子間無(wú)團(tuán)聚現(xiàn)象，具有良好的分散性且二氧化硅包覆顆粒的分散性明顯好于單純Fe3O4顆粒。
　　(2)從SiO2包裹納米顆粒的紅外光譜圖上可看到Si-O和Fe-O的特征峰，它的飽化磁化強(qiáng)度為55 emu/g

3、，無(wú)磁滯和剩磁現(xiàn)象，表現(xiàn)出明顯的超順磁性現(xiàn)象。
　　(3)每mg SiO2包裹納米顆粒能固定鏈霉親和素的最大量為146μg;每mg鏈霉親和素修飾的納米顆粒能結(jié)合生物素最大量為1215 ng。
　　(4)通過(guò)鏈霉親和素-生物素的相互作用能將CccDNA特異性寡核苷酸固定在磁性納米微粒表面，偶聯(lián)前后上清液在260 nm的特征吸收峰有明顯變化，并且偶聯(lián)后上清液中核酸濃度和OD260值均明顯下降。通過(guò)OD260值變化計(jì)算出親和素修飾

4、的納米顆粒最大結(jié)合生物素標(biāo)記探針量約3200 pmol/mg。
　　(5) CccDNA功能化納米顆粒與其互補(bǔ)FITC標(biāo)記寡核苷酸序列雜交后，用熒光顯微鏡觀察到磁性分離后上清液的熒光信號(hào)明顯減弱，變性后其上清液熒光強(qiáng)度又明顯增強(qiáng)。通過(guò)熒光強(qiáng)度改變計(jì)算出功能化納米顆粒對(duì)互補(bǔ)探針最大捕獲量大約是2000 pmol/mg。
　　結(jié)論:構(gòu)建的CccDNA功能化納米微粒能有效捕獲與其互補(bǔ)的序列，其捕獲量能達(dá)到CccDNA的分離提取要求

5、，為CccDNA定量檢測(cè)方法建立奠定了基礎(chǔ)。
　　第二部分 HBV CccDNA標(biāo)準(zhǔn)品的制備與定量
　　目的:通過(guò)構(gòu)建HBV全基因組重組質(zhì)粒來(lái)制備HBV CccDNA標(biāo)準(zhǔn)品，為CccDNA定量方法建立和性能驗(yàn)證提供標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品。
　　方法:提取慢性乙肝患者血清DNA，用高保真PCR法擴(kuò)增HBV全基因組片段，通過(guò)T-A克隆建立HBV全基因組質(zhì)粒，以HBV全基因組質(zhì)粒為模板，經(jīng)酶切、連接、濃縮、膠回收及純化等手段構(gòu)建HB

6、V CccDNA標(biāo)準(zhǔn)品。
　　結(jié)果:
　　(1)從慢性乙肝患者血清中擴(kuò)增出3.2 kb左右大小的DNA片段通過(guò)T-A克隆插入pMD18-T載體，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ酶消化得到預(yù)期的2.7kb和3.2 kb兩個(gè)片段;
　　(2)經(jīng)測(cè)序鑒定，構(gòu)建的兩個(gè)質(zhì)粒分別屬HBV基因型B和C，在DR1和DR2區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)的4條探針序列和一條上游引物序列都與測(cè)序結(jié)果中匹配，擴(kuò)增序列的保真性好，錯(cuò)配率符合要求。
　　

7、(3)兩個(gè)重組質(zhì)粒經(jīng)酶切、連接、膠回收和純化成功構(gòu)建CccDNA標(biāo)準(zhǔn)品。兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)real-time PCR定量，它們的濃度分別是1.05×1010IU/mL和6.19×109 IU/mL，分別命名為CccDNA-B和CccDNA-C。
　　結(jié)論:本部分實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了HBV全基因組重組質(zhì)粒和CccDNA標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)測(cè)序和定量證實(shí)，構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)品可以作為下一步方法建立和性能驗(yàn)證的標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品。
　　第三部分 HBV CccDN

8、A磁性捕獲雜交定量PCR方法建立及初步評(píng)價(jià)
　　目的:建立磁性捕獲雜交定量PCR方法，并對(duì)該方法靈敏度、特異性、干擾、檢測(cè)線性及正確度等評(píng)價(jià)，以確認(rèn)建立的方法能滿足常規(guī)檢測(cè)需求。
　　方法:設(shè)計(jì)跨缺口引物選擇性擴(kuò)增磁性雜交捕獲分離的CccDNA，建立磁性捕獲雜交實(shí)時(shí)定量PCR方法，將4種不同探針磁性納米微粒與一定量的標(biāo)準(zhǔn)品雜交不同的時(shí)間(1h、2h和3h)，確定最適宜的探針和最佳雜交條件;10倍系列稀釋HBV CccDNA標(biāo)

9、準(zhǔn)品，取一定量標(biāo)準(zhǔn)品與最有效探針進(jìn)行雜交分離，檢測(cè)磁性納米微粒捕獲HBV CccDNA含量，確定方法檢測(cè)靈敏度和線性;將不同濃度的CccDNA標(biāo)準(zhǔn)品與一定量干擾物混合，檢測(cè)經(jīng)磁性納米微粒捕獲的HBV CccDNA含量，以確定方法檢測(cè)特異性和干擾;用建立的磁性納米微粒捕獲雜交定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞株HepG2.2.15連續(xù)培養(yǎng)4d細(xì)胞中CcDNA含量和檢測(cè)10例血清標(biāo)本中CccDNA，對(duì)方法進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。
　　結(jié)果:
　　(1)

10、4條探針均能雜交捕獲CccDNA，除25-mer探針外，其余3條探針在不同雜交時(shí)間內(nèi)都能達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)品預(yù)期濃度，其中49-mer探針在62℃1h雜交條件下能有效捕獲CccDNA，被選為后續(xù)實(shí)驗(yàn)探針。
　　(2)磁性納米微粒捕獲雜交定量PCR方法檢測(cè)靈敏度為102 IU/mL(20copies/mL)，108 IU/mL RcDNA對(duì)本方法無(wú)干擾，MCH-qPCR檢測(cè)濃度與加入預(yù)期濃度之間呈明顯線性關(guān)系(R2=0.994，F(xiàn)=507.5

11、，p＜0.01)，方法正確度與特異性符合要求。
　　(3) HepG2.2.15細(xì)胞在連續(xù)培養(yǎng)4d后，MCH-qPCR檢測(cè)其上清CcDNA濃度分別是4.02×103 IU/mL、1.04×102 IU/mL、4.38×102 IU/mL和5.01×103IU/mL，質(zhì)控結(jié)果符合預(yù)期，表明MCH-qPCR法能從HepG2.2.15細(xì)胞株上清中檢測(cè)出CccDNA。
　　(4)10例CHB患者標(biāo)本HBV DNA濃度達(dá)107 IU/

12、mL，8例標(biāo)本中檢測(cè)出CccDNA;用功能化納米微粒對(duì)Hirt法提取的tDNA進(jìn)行MCH-qPCR檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果顯著低于Hirt提取后的直接檢測(cè)組，差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。
　　結(jié)論:成功建立檢測(cè)CccDNA的MCH-qPCR方法，方法檢測(cè)靈敏度低(102IU/mL)，正確度高，特異性好，符合常規(guī)檢測(cè)要求。
　　第四部 HBV CccDNA磁性捕獲雜交定量PCR法初步臨床應(yīng)用
　　目的:通過(guò)MCH-

13、qPCR方法來(lái)檢測(cè)血清、肝組織及外周單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)CccDNA及分析CHB血清中CccDNA和血清HBV DNA、ALT等之間的關(guān)系，以幫助對(duì)MCH-qPCR方法臨床應(yīng)用評(píng)價(jià)以及了解CccDNA在HBV感染過(guò)程中的變化。
　　方法:收集肝臟組織標(biāo)本、慢性乙肝患者血清標(biāo)本，經(jīng)Hirt法提取總DNA后進(jìn)行HBV DNA和CccDNA檢測(cè);收集外周血標(biāo)本，進(jìn)行外周血單個(gè)核細(xì)胞分離后用質(zhì)粒提取法提取總DNA后進(jìn)行HBV DNA和CccDNA

14、檢測(cè);分析不同標(biāo)本類型中CccDNA與HBVDNA之間的關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　(1)28例肝組織標(biāo)本中，21例標(biāo)本檢測(cè)出HBV DNA，15例標(biāo)本檢測(cè)出HBVCccDNA，它們之間存在明顯正相關(guān)(p＜0.01，R2=0.824)。
　　(2)21例乙肝患者外周血標(biāo)本中，PBMCs內(nèi)檢測(cè)出HBV DNA共7例，檢出率33.3％;檢測(cè)出CccDNA共4例，檢出率為19.0％。血清HBV DNA與PBMCs內(nèi)CccDNA及

15、HBV DNA濃度對(duì)數(shù)值無(wú)相關(guān)性(R2=0.111和R2=0.104)。
　　(3)82例乙肝患者血清標(biāo)本中，檢測(cè)出CccDNA共48例，檢出率為58.5％。35例HBeAg陰性CHB患者有12例血清標(biāo)本中檢測(cè)出CccDNA，檢出率為34.3％;47例HBeAg陽(yáng)性CHB患者有36例標(biāo)本血清檢測(cè)出CccDNA，檢出率為76.6％。ALT水平高低對(duì)于CccDNA檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯影響(pearson=0.04，p=0.851＞0.05)

16、。所有82樣本HBVDNA與CccDNA之間僅弱的相關(guān)性(R2=0.24，F(xiàn)=15.165，p＜0.05); HBeAg陽(yáng)性組HBV DNA與CccDNA間也有弱的相關(guān)性(R2=0.167，F(xiàn)=7.613，p＜0.05);HBeAg陰性組HBV DNA與CccDNA間沒(méi)有相關(guān)性(R2=0.042，F(xiàn)=0.352p＞0.05)。
　　結(jié)論:MCH-qPCR方法從肝組織、外周血單個(gè)核細(xì)胞及血清中均可檢測(cè)出CccDNA，肝組織中CccD