1、背景：近年來，分子影像對(duì)疾病診療的關(guān)鍵作用日益彰顯，目前已篩選出大量決定疾病發(fā)展進(jìn)程的關(guān)鍵分子靶點(diǎn)，并針對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行定性和定量研究。而作為最早應(yīng)用于分子影像學(xué)的成像技術(shù)，核醫(yī)學(xué)成像是為數(shù)不多的進(jìn)入臨床應(yīng)用階段的分子成像技術(shù)。納米技術(shù)不斷發(fā)展，促進(jìn)了核醫(yī)學(xué)診斷和治療的發(fā)展，特別是在選擇性輸送生物活性物質(zhì)到疾病發(fā)生位點(diǎn)方面。
　　由于樹狀納米粒PAMAM表面具有大量的活性基團(tuán)，可以通過雙功能螯合劑連接多個(gè)放射性核素和靶向分子，因此在低濃

2、度條件下可形成對(duì)比度很高的診斷影像。近來，PAMAM在腫瘤診斷和治療中的應(yīng)用研究吸引了越來越多的研究者的關(guān)注，目前這個(gè)方向已經(jīng)發(fā)展成為納米醫(yī)藥方面研究的一個(gè)新選擇，是藥物運(yùn)輸系統(tǒng)以及制藥科學(xué)中的一個(gè)研究熱點(diǎn)。
　　樹狀納米分子與特殊肽類的結(jié)合能夠明顯地增加藥物與酶傳遞的靶向效率。RGD作為抗腫瘤藥物的靶向載體，目前的相關(guān)研究已經(jīng)相當(dāng)?shù)某墒欤ㄟ^與αvβ3整合蛋白的特異性結(jié)合，可增加病灶局部的藥物濃度，減輕抗腫瘤藥物的不良反應(yīng)。

3、r>　　同時(shí)，具有雙功能團(tuán)的MAL-PEG-NHS作為納米載體與靶向多肽的“橋梁”，能夠把PAMAM與RGD連接在一起。在以往的研究中，已有不少研究者利用PEG修飾PAMAM，以改善其生物相容性、并進(jìn)行藥物和基因的傳遞、釋放，以及腫瘤的顯像。PEG的加入不僅降低了PAMAM載體的毒性，而且進(jìn)一步提高了載藥系統(tǒng)的親水性。
　　131I一直是內(nèi)放射治療的經(jīng)典放射性核素，半衰期為8.04天，131I衰變時(shí)發(fā)射的β射線，能量為0.608M

4、eV，可用于內(nèi)照射治療，而同時(shí)發(fā)射的γ射線可進(jìn)行體外顯像。基于其優(yōu)良的生化性質(zhì)，幾十年應(yīng)用不衰，而且不斷用于研制新的藥物，如標(biāo)記一些單克隆抗體等，131I在生物導(dǎo)向治療中一直發(fā)揮著重要作用。131I標(biāo)記工藝技術(shù)至今相當(dāng)成熟，其中標(biāo)記化學(xué)合成法直接標(biāo)記法中以Iodogen法和氯胺-T法為主?；?31I在臨床及基礎(chǔ)研究中的成功應(yīng)用，本實(shí)驗(yàn)選擇氯胺T直接標(biāo)記法對(duì)納米載體進(jìn)行放射性131I的標(biāo)記，使之成為靶向腫瘤的治療藥物。
　　本研究

5、以樹狀納米粒（PAMAM）作為納米載體，RGD作為腫瘤導(dǎo)向分子修飾藥物載體，并用放射性核素131I進(jìn)行靶向分子標(biāo)記，合成131I-RGDyC-PEG-PAMAM復(fù)合體。與傳統(tǒng)的單一樹狀載體相比，這種新型聚合載體能同時(shí)實(shí)現(xiàn)治療、成像和靶向的作用，所取得的研究成果也將具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。本研究主要分為四個(gè)部分，第一部分是合成放射性碘標(biāo)記的前體RGDyC-PEG-PAMAM并檢測其質(zhì)量；第二部分對(duì)具有靶向性的納米載體進(jìn)行放射性碘標(biāo)記，并檢

6、測其質(zhì)量；第三部分為納米探針在生物活性上的研究，包括細(xì)胞水平與動(dòng)物水平的研究。最終探討將其應(yīng)用于體內(nèi)靶向腫瘤顯像和診治藥物的可能性。
　　目的：
　　1、化學(xué)合成 RGDyC-PEG-PAMAM碘標(biāo)前體，并對(duì)其化學(xué)性質(zhì)、物理性質(zhì)等進(jìn)行質(zhì)量鑒定，評(píng)價(jià)其是否可用于下一步131I的標(biāo)記。
　　2、用131I標(biāo)記RGDyC-PEG-PAMAM納米復(fù)合物，制備131I-RGDyC-PEG-PAMAM放射性納米探針，并對(duì)其標(biāo)記率、

7、穩(wěn)定性、脂水分配系數(shù)等性質(zhì)進(jìn)行鑒定，評(píng)價(jià)其是否可用于下一步生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
　　3、初步評(píng)估131I-RGDyC-PEG-PAMAM納米探針在體外細(xì)胞水平是否對(duì)腫瘤細(xì)胞有靶向性，并具有放射抑制的作用，為后續(xù)進(jìn)行荷瘤鼠體內(nèi)腫瘤顯像和抗腫瘤研究奠定基礎(chǔ)。
　　4、初步評(píng)估131I-RGDyC-PEG-PAMAM納米探針在動(dòng)物水平上的藥物分布、顯像效果。
　　方法：
　　第一部分、放射性標(biāo)記前體RGDyC-PEG-PAMA

8、M的制備
　?。?）化學(xué)合成：在弱酸條件下雙功能 PEG（NHS-PEG-MAL）上的馬來酰亞胺基團(tuán)先與RGDyC上的巰基基團(tuán)反應(yīng)。稱取雙功能PEG（NHS-PEG-MAL）40mg（17.22μmol），加入到含有環(huán)狀RGDyC（4mg,6.72μmol）的乙酸鈉緩沖液（NaAc-HAc1ml0.1M pH6.0）中，在磁力攪拌器的攪拌下反應(yīng)30s。把上一步反應(yīng)中混合產(chǎn)物迅速轉(zhuǎn)移至溶解有PAMAM納米分子（4.2mg，0.15μ

9、mol）的硼酸（硼砂-NaOH）緩沖液（1ml0.05M pH9.0）中，磁力攪拌下反應(yīng)12h。12h后把反應(yīng)混合物的pH值調(diào)至7.0，再加入β-巰基乙醇（2μl，28μmol）結(jié)合未反應(yīng)的馬來酰亞胺基團(tuán)，1h后通過超濾（Amicon Ultra-4, MWCO10000;4500rpm,15min,9times）去除游離PEG和RGDyC，把純化后產(chǎn)物的水溶液凍干得淺黃色固體即為產(chǎn)物RGDyC-PEG-PAMAMA。
　?。?）

10、基本性質(zhì)檢測：稱取5mg RGDyC-PEG-PAMAMA溶于0.6ml重水（D2O）中，采用核磁共振波譜儀檢測其物質(zhì)表征。用雙蒸水溶解稀釋1mg RGDyC-PEG-PAMAMA后，再采用紫外光譜儀表征、用納米粒度及Zeta電位分析儀檢測粒徑分布和電位、用透射電鏡（TEM）觀察其形態(tài)大小及分布。
　　第二部分、放射性納米探針131I-RGDyC-PEG-PAMAM的制備
　　（1）化學(xué)合成：采用氯胺-T的方法進(jìn)行放射性核素

11、131I的標(biāo)記。稱取1.5mg RGDyC-PEG-PAMAMA，溶于100μl PBS緩沖液（pH7.4），再加入Na131I溶液2mCi（74MBq，200μl），然后加入氯胺-T300μl（5mg/ml），震蕩反應(yīng)3min后，加入300ul（5mg/ml）偏重亞硫酸鈉溶液終止反應(yīng)，完成標(biāo)記。
　?。?）基本性質(zhì)檢測：
　?、贅?biāo)記率采用快速薄層層析法（ITLC）測定。固定相為：ITLC-SG層析紙，展開劑為甲醇。取2μl

12、反應(yīng)液點(diǎn)樣于ITLC-SG紙（10mm×150mm上），于甲醇中上行展開，空氣中自然晾干。在展開體系中，游離131I隨溶劑移到層析紙前沿，其Rf為0.9～1.0；而標(biāo)記物131I-RGDyC-PEG-PAMAMA停留在原點(diǎn)，Rf為0.0～0.1。用Bioscan薄層放射性掃描儀對(duì)層析紙條進(jìn)行掃描，并計(jì)算放射性標(biāo)記率（％）。
　?、诜€(wěn)定性檢測：取100μl標(biāo)記后的產(chǎn)物131I-RGDyC-PEG-PAMAMA，分別加入到1ml的新生

13、牛血清和1ml的PBS中。置于37℃水浴箱中孵育2、12、24、72h，分別于不同時(shí)間點(diǎn)取少量樣品用快速薄層層析法測定其放化純度，以鑒定其體外穩(wěn)定性。
　?、壑峙湎禂?shù)測定：在離心管內(nèi)同時(shí)加入500μl正辛醇和480μl PBS，并取20μl131I-RGDyC-PEG-PAMAMA加入該管，用膠封膜密封，充分震蕩均勻后，高速離心3min（10000rpm），至正辛醇與PBS兩相平衡。從有機(jī)相和水相各取樣100μl分別置于兩只離

14、心管中，分別測量其放射性計(jì)數(shù)。重復(fù)取樣測定三次。按下式計(jì)算脂水分配系數(shù)，log P=log（cts正辛醇/cts PBS）。
　　第三部分、生物活性實(shí)驗(yàn)
　?。?）細(xì)胞培養(yǎng)：人肺腺癌A549細(xì)胞在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含有10%胎牛血清、青霉素（100IU/mL）及鏈霉素（100IU/mL）的RPMI1640培養(yǎng)液，每兩天更換培養(yǎng)介質(zhì)。當(dāng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶后用0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA和0.01m

15、ol/L PBS（pH7.4）緩沖液分離用于進(jìn)一步細(xì)胞培養(yǎng)、傳代、凍存。
　?。?）細(xì)胞攝取及洗脫實(shí)驗(yàn)：
　　①攝取實(shí)驗(yàn)：在24孔板中每孔加入5×104個(gè)A549細(xì)胞，隔夜培養(yǎng)使其貼壁。隔天取出培養(yǎng)基，細(xì)胞分為兩組，分別加入10μCi/孔的131I-RGDyC-PEG-PAMAMA和131I-的無血清培養(yǎng)液，在37℃孵育1、2、4、6h。之后再用冰凍PBS緩沖液沖洗3遍，最后用胰蛋白酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液用γ計(jì)數(shù)儀測量計(jì)數(shù)

16、。細(xì)胞攝取數(shù)據(jù)經(jīng)衰減校正后用百分加入劑量表示作細(xì)胞結(jié)合率，實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行樣。
　　②洗脫實(shí)驗(yàn)：在24孔板中每孔加入5×104個(gè)A549細(xì)胞，隔夜培養(yǎng)使其貼壁。隔天取出培養(yǎng)基，細(xì)胞分為兩組，分別加入10μCi/孔的131I-RGDyC-PEG-PAMAMA和131I-的無血清培養(yǎng)液，在37℃孵育2h使其充分與細(xì)胞結(jié)合。然后取出培養(yǎng)液，用冰凍PBS沖洗3遍，再加入無血清培養(yǎng)液再孵育1、2、4、6h。之后再用冰凍PBS緩沖液沖洗3遍，最

17、后用胰蛋白酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液用γ計(jì)數(shù)儀測量計(jì)數(shù)。細(xì)胞攝取數(shù)據(jù)經(jīng)衰減校正后用百分加入劑量作為細(xì)胞滯留率，實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行樣。
　?。?）藥物對(duì)細(xì)胞的抑制作用：等細(xì)胞數(shù)（1×103）的A549細(xì)胞置于96孔板中，分為131I-RGDyC-PEG-PAMAM組、RGDyC-PEG-PAMAM組、131I-組、PBS對(duì)照組4個(gè)組，每組設(shè)9個(gè)復(fù)孔，一個(gè)空白對(duì)照孔。用MTT法分別檢測A549細(xì)胞藥物處理24、48、72h后細(xì)胞的存活率。<

18、br>　?。?）細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)：等細(xì)胞數(shù)（2×105）的A549細(xì)胞置于6孔板中，分為131I-RGDyC-PEG-PAMAM組、131I-組、空白對(duì)照組3個(gè)組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測納米載體作用于細(xì)胞所引起的凋亡情況，
　?。?）荷瘤裸鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建：建立A549細(xì)胞荷瘤裸鼠動(dòng)物模型，采用腋窩皮下細(xì)胞懸浮液注射的方法構(gòu)建移植瘤。
　?。?）131I-RGDyC-PEG-PAMAM在正常鼠體內(nèi)的不同臟器

19、的放射性分布情況。
　?、?31I-RGDyC-PEG-PAMAM的荷瘤鼠體內(nèi)注射：先給予2%KI溶液的飲水使荷瘤鼠模型甲狀腺封閉，持續(xù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，以減少甲狀腺組織攝碘。
　?、跈z測注射藥物后，不同時(shí)刻小鼠不同臟器的放射性藥物的分布情況。
　　（7）131I標(biāo)記的納米藥物載體的荷瘤鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：
　　①131I-RGDyC-PEG-PAMAM的荷瘤鼠體內(nèi)注射：先給予2%KI溶液的飲水使荷瘤鼠模型甲狀腺封閉，持續(xù)至實(shí)

20、驗(yàn)結(jié)束，以減少甲狀腺組織攝碘。
　?、诓煌o藥方式注射藥物后，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)荷瘤鼠的SPECT顯像。
　　結(jié)果：
　　第一部分、放射性標(biāo)記前體RGDyC-PEG-PAMAM的制備
　　合成的放射性標(biāo)記前體 RGDyC-PEG-PAMAM呈淡黃色，經(jīng)核磁共振氫譜（400MHz, D2O）、紫外吸收光譜確認(rèn)為目標(biāo)產(chǎn)物，RGDyC-PEG-PAMAMA的流體動(dòng)力學(xué)的平均粒徑為32.67nm。TEM圖像顯示合成的RGDyC-

21、PEG-PAMAMA為球型納米復(fù)合體，總體直徑大小在22nm左右。
　　第二部分、放射性納米探針131I-RGDyC-PEG-PAMAM的制備
　　131I標(biāo)記RGDyC-PEG-PAMAM的標(biāo)記率>95%、比活度計(jì)算為0.08mCi/mg，72h內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)其穩(wěn)定性檢測，結(jié)果顯示：至72h時(shí)，131I-RGDyC-PEG-PAMAM在不同溶液中（胎牛血清、PBS）均具有良好穩(wěn)定性。經(jīng)脂水分配系數(shù)實(shí)驗(yàn)測定納米探針的log P

22、=-1.59±0.09，表明此分子探針具有明顯親水性。
　　第三部分、生物活性實(shí)驗(yàn)
　?。?）細(xì)胞攝取及洗脫實(shí)驗(yàn)：相對(duì)于游離131I-，131I-RGDyC-PEG-PAMAM納米探針能夠與A549細(xì)胞特異性結(jié)合，而且隨著孵育時(shí)間延長，其對(duì) A549細(xì)胞結(jié)合率進(jìn)一步提高。在細(xì)胞洗脫實(shí)驗(yàn)中，藥物131I-RGDyC-PEG-PAMAM組隨著時(shí)間的延長細(xì)胞中的藥物出現(xiàn)少量洗脫出來的現(xiàn)象，但變化不太明顯，而游離131I-在細(xì)胞中的

23、含量從開始一直處于低水平。
　?。?）體外細(xì)胞抑制和凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：藥物131I-RGDyC-PEG-PAMAM對(duì)A549細(xì)胞產(chǎn)生一定的抑制作用，且與作用時(shí)間有一定關(guān)系，72h內(nèi)時(shí)間越長對(duì)細(xì)胞的抑制越明顯。在促凋亡方面，相對(duì)于游離131I-，131I-RGDyC-PEG-PAMAM的作用較強(qiáng)，且與藥物劑量有關(guān)，在劑量較高情況下，納米探針對(duì)A549有一定促凋亡和放射殺傷作用。
　　（3）動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)
　?、袤w內(nèi)生物學(xué)分布

24、顯示：正常小鼠注射131I-RGDyC-PEG-PAMAM后，體內(nèi)攝取值較高的是腎臟、肝臟，其次是脾臟、小腸及甲狀腺，而血液、心臟、肌肉及骨骼等臟器的攝取非常少，說明藥物主要通過肝、腎進(jìn)行代謝排泄。
　　②通過不同的給藥方式分別將131I-RGDyC-PEG-PAMAM、游離131I-注射入不同的荷瘤鼠體內(nèi)進(jìn)行雙模態(tài)成像，在不同時(shí)間 SPECT顯像分析藥物探針131I-RGDyC-PEG-PAMAM在荷A549腫瘤裸鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)

25、力學(xué)特征及腫瘤靶向特征。結(jié)果顯示：腫瘤顯影較好，同等條件下與對(duì)照組游離131I-組相比，納米探針在腫瘤局部具有較長的滯留時(shí)間，而131I-很快就被排除體外，說明納米探針與腫瘤的結(jié)合具有很好的親和力，具有特異性結(jié)合的作用，特別是瘤內(nèi)注射方式，其藥物在腫瘤中的聚集程度與藥物滯留時(shí)間均優(yōu)于尾靜脈注射給藥。另外，肝腎對(duì)藥物的攝取較高，肌肉攝取較低，與體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)相似。
　　結(jié)論：可通過“一鍋兩步”法及點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)成功制備標(biāo)記前體RGDyC

26、-PEG-PAMAM，此化學(xué)合成方法簡便、快捷、高效。合成后的前體通過氯胺T直接標(biāo)記法成功進(jìn)行131I標(biāo)記，合成131I-RGDyC-PEG-PAMAM放射性探針，并獲得較高標(biāo)記率、穩(wěn)定性和親水性。隨后的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示131I-RGDyC-PEG-PAMAM對(duì)A549細(xì)胞有一定的抑制生長、促凋亡和放射殺傷的作用。131I-RGDyC-PEG-PAMAM納米探針體內(nèi)分布說明藥物主要以肝臟與腎代謝排泄為主，其他臟器組織的攝取不高，與