1、我國是中醫(yī)藥的發(fā)源地，中醫(yī)藥文化源遠(yuǎn)流長(zhǎng)。中藥注射劑是中藥制劑的新劑型，相對(duì)其他中藥劑型，它不僅保留了中藥的特性，而且兼具有西藥藥效快、使用方便、生物利用率高、劑量更為準(zhǔn)確、療效確切等特點(diǎn)。從而得到快速發(fā)展。根據(jù)WHO(World Health Organization)對(duì)于藥物不良反應(yīng)的統(tǒng)計(jì)資料表明：近幾年來，藥物不良反應(yīng)發(fā)生率一般為5～20％，住院病人約有10～41.5％發(fā)生藥物不良反應(yīng)。藥物作為防治疾病、調(diào)節(jié)人體生理機(jī)能的特殊物質(zhì)

2、，雖然在上市前已做過非臨床安全性評(píng)價(jià)、臨床試驗(yàn)，但由于非臨床前研究的局限性和上市前臨床研究的局限性，一些發(fā)生頻率低于1％的不良反應(yīng)和一些需要較長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)用才能發(fā)生及遲發(fā)性的不良反應(yīng)未能發(fā)現(xiàn)，加上藥物不良反應(yīng)的發(fā)現(xiàn)存在滯后現(xiàn)象特點(diǎn)，因此對(duì)藥物上市后再評(píng)價(jià)更顯其重要性和必要性。
　　 葛根素系從豆科植物野葛或甘葛藤根中提出的一種黃酮苷，是葛根素注射劑主要成分。作為血管擴(kuò)張藥，有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈和腦血管、降低心肌耗氧量，改善微循環(huán)和抗血小板

3、聚集的作用。由于葛根素與其他治療心腦血管疾病的藥物相比具有療效好、價(jià)格低的優(yōu)勢(shì)。因而，臨床應(yīng)用非常廣泛。在全國樣本醫(yī)院心腦血管疾病用藥銷售額排序前10位的藥品中，葛根素排列第三，2003年總銷售量已達(dá)20億元人民幣以上。但是，隨著葛根素的廣泛應(yīng)用，有關(guān)其不良反應(yīng)的報(bào)道逐漸增多，而急性血管內(nèi)溶血是葛根素注射劑最嚴(yán)重的不良反應(yīng)。因此，葛根素注射液致血管內(nèi)溶血成為其使用的巨大障礙，盡管在2003年1月至2006年，國家藥品不良反應(yīng)中心對(duì)其急性

4、血管內(nèi)溶血進(jìn)行多次通報(bào)和SFDA多次發(fā)布葛根素管理和使用措施通知，但其血管內(nèi)溶血機(jī)制仍不十分清楚。
　　 鑒于葛根素注射液致急性血管內(nèi)溶血的嚴(yán)重性，本課題根據(jù)《中藥注射液安全性再評(píng)價(jià)基本技術(shù)要求》和葛根素注射液臨床不良反應(yīng)特征，選擇急性毒性試驗(yàn)和例外溶血試驗(yàn)進(jìn)行安全性再評(píng)價(jià)，進(jìn)而在此基礎(chǔ)上，通過體外試驗(yàn)的紅細(xì)胞毒理學(xué)深入探討了葛根素致紅細(xì)胞溶血反應(yīng)發(fā)生的機(jī)制。開展葛根素注射液毒性機(jī)制研究，不僅有較大的應(yīng)用價(jià)值和學(xué)術(shù)價(jià)值，而且為葛

5、根素進(jìn)一步結(jié)構(gòu)改造，降低毒性及不良反應(yīng)提供依據(jù)，有助于減少葛根素臨床使用中的風(fēng)險(xiǎn)，確?；颊叩挠盟幇踩?。
　　 急性毒性試驗(yàn)采用Bliss法測(cè)定LD50及其它相關(guān)參數(shù)。300-600mg·kg-1之間分為5個(gè)劑量組，單次尾靜脈注射，15 mg·mL-1給藥容積。結(jié)果：死亡動(dòng)物，表現(xiàn)為俯臥、低伏、運(yùn)動(dòng)失調(diào)、震顫、強(qiáng)直性抽搐、驚跳反射、痙攣等癥狀，最終死亡，死亡時(shí)間均在注射后即刻至3 min內(nèi)；未死亡動(dòng)物，上述癥狀逐漸減弱，約20 m

6、in后基本恢復(fù)正常。所有試驗(yàn)小鼠人體解剖未見明顯異常，未發(fā)現(xiàn)特異性靶器官。經(jīng)計(jì)算雄性、雌性小鼠LD50分別為：415.2(374.4～460.4)、439.2(371.6～519.1)mg·kg-1；溶媒丙二醇組，試驗(yàn)小鼠全部存活；減小給藥容積至10 mg·mL-1，中毒癥狀及死亡未明顯改變，雄性、雌性LD50為：466.8(417.6～521.9)mg·kg-1、450.4(409.7-495.1)mg·kg-1；分別使用0.9％Na

7、Cl注射液和5％葡萄糖注射液稀釋葛根素濃度于0.4～40 mg·mL-1之間，pH值均小于4.0。結(jié)果提示：葛根素注射液急性毒性時(shí)動(dòng)物死亡原因與過敏反應(yīng)、溶血反應(yīng)、動(dòng)物性別、給藥容積和臨床使用溶劑無關(guān)，溶劑丙二醇對(duì)葛根素注射液急性毒性無影響，給藥速度和溶液pH對(duì)葛根素注射液急性毒性有影響。
　　 體外溶血試驗(yàn)依據(jù)《中藥、天然藥物局部刺激性和溶血性試驗(yàn)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》，考察不同濃度葛根素注射液和丙二醇對(duì)不同紅細(xì)胞溶血率和凝集性。

8、用0.9％NaCl注射液將葛根素注射液稀釋為濃度0.5、1、2、4、8和16 mg·mL-1，與新鮮的2％紅細(xì)胞懸液混勻后置于37℃溫育6 h后，OD490測(cè)吸光度值，計(jì)算紅細(xì)胞溶血率和觀察凝聚反應(yīng)。結(jié)果葛根素對(duì)比格犬、人及家兔紅細(xì)胞體外溶血的半數(shù)溶血濃度分別為：2.79、3.96和.5.47 mg·mL-1；引起三種紅細(xì)胞最大溶血率時(shí)葛根素濃度分別為：65.36、81.89和135.06 mg·mL-1；三種紅細(xì)胞毒-效反應(yīng)關(guān)系的斜率

9、分別為：1.45、1.96和0.49。大劑量葛根素可使三種紅細(xì)胞產(chǎn)生假凝集現(xiàn)象，而丙二醇則無此現(xiàn)象。結(jié)果顯示：一定劑量的葛根素注射液使三種紅細(xì)胞均產(chǎn)生明顯溶血，溶血率與葛根素劑量呈正相關(guān)；值得注意的是：人紅細(xì)胞劑量-效應(yīng)反應(yīng)曲線的斜率最大，說明一旦達(dá)到能夠引起溶血的濃度，會(huì)很快達(dá)到最大溶血率，提示：在一些疾病狀態(tài)下，以及輸液速度快等情況時(shí)，易發(fā)生急性血管內(nèi)嚴(yán)重溶血；溶劑丙二醇在使用濃度下，對(duì)葛根素注射液溶血性無影響；鑒于葛根素引起的不同

10、種屬紅細(xì)胞溶血均具有劑量.效應(yīng)關(guān)系，及不引起紅細(xì)胞凝集，提示：葛根素所引起的急性溶血為藥源性非免疫性溶血。
　　 從生理、生化角度出發(fā)，考察溶血源葛根素對(duì)紅細(xì)胞滲透脆性、紅細(xì)胞膜氧化性、紅細(xì)胞形態(tài)、ATP能量代謝等的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：高劑量葛根素，紅細(xì)胞開始溶血及完全溶血時(shí)NaCl濃度差大于0.08％，而丙二醇高劑量組空白對(duì)照組的紅細(xì)胞開始溶血及完全溶血時(shí)NaCl濃度與組無差異，大劑量葛根素可使紅細(xì)胞膜滲透脆性增強(qiáng)；葛根素注射液及

11、丙二醇隨劑量與紅細(xì)胞膜熒光偏振度和微粘度呈負(fù)相關(guān)，流動(dòng)性正相關(guān)，而葛根素注射液組與丙二醇組比較，紅細(xì)胞膜熒光偏振度和微粘度??；低劑量葛根素注射液組，大鼠紅細(xì)胞SOD、GSH-Px活性升高，高劑量葛根素組，大鼠紅細(xì)胞SOD、GSH-Px活性降低。而丙二醇組，隨劑量增加，SOD、GSH-Px活性增加。低劑量時(shí)，葛根素注射液和丙二醇組均使MDA升高，隨二者劑量增加，MDA含量均減少；丙二醇組SA含量低于相應(yīng)葛根素注射液組，且二者SA含量均低于

12、空白對(duì)照組；葛根素注射液組紅細(xì)胞膜表面Na+-K+-ATPase的活性升高；高劑量組紅細(xì)胞膜表面Ca2+-Mg2+-ATPase活性降低，低劑量組Ca2+-Mg2+-ATPase活性降低升高；隨劑量增加，不規(guī)則形狀紅細(xì)胞數(shù)量增加，并且聚集，粘連逐漸增加。而丙二醇(10％)組紅細(xì)胞形態(tài)未發(fā)現(xiàn)明顯異常；高濃度葛根素注射液與紅細(xì)胞作用后，同樣可使骨架蛋白表達(dá)的減少及部分蛋白條帶的表達(dá)異常增加。
　　 綜合上述研究結(jié)果，我們認(rèn)為：溶劑丙

13、二醇、給藥容積和動(dòng)物性別對(duì)葛根素注射液急性毒性無影響；而溶液pH值和給藥速度可能對(duì)葛根素注射液急性毒性產(chǎn)生影響；葛根素注射液在體外能夠引起藥源性非免疫性溶血；溶劑丙二醇對(duì)葛根素注射液溶血無影響；機(jī)體在病理狀態(tài)或快速給藥時(shí)，可能容易誘發(fā)急性血管內(nèi)溶血等不良反應(yīng)的產(chǎn)生；葛根素可與紅細(xì)胞膜蛋白或膜相互作用，改變膜結(jié)構(gòu)和狀態(tài)，增加紅細(xì)胞膜在低滲溶液中的滲透脆性，增加膜流動(dòng)性，通過抑制SOD、GSH-Px、Ca2+-Mg2+-ATPase活性和干