1、物種在進化過程中一直伴隨著基因組序列的變異，而基因組序列的變異又是物種進化的源動力。小麥是異源六倍體作物，在形成過程中因“雜合性”和“多倍性”引起的基因組沖擊使小麥基因組發(fā)生了高頻率的基因組變異，使多倍體“二倍體化”。本實驗室利用非對稱體細胞雜交方法獲得了普通小麥(Triticum aestivum L.，2n=42)濟南177(JN177)與長穗偃麥草(Thinopyrum ponticum，2n=70)的漸滲系小麥耐鹽、抗旱和優(yōu)質新

2、品種山融3號(SR3)。非對稱體細胞雜交過程中會發(fā)生雙親基因組短暫共存于一個細胞核、供體染色質大規(guī)模消減和少量供體染色質漸滲到受體基因組等事件，因而是一種特殊的二倍體化，也能引起強烈的基因組沖擊，并產生系統(tǒng)性的基因組變異。但至今非對稱雜交介導的基因組變異特征和機制及其和異源多倍體化的差異還未見報道。
　　 本實驗室分子標記和功能基因分析顯示，SR3基因組發(fā)生了遺傳學和表觀遺傳學變異，但變異程度和特征仍不清楚。本試驗擬構建SR3和

3、親本小麥JN177的cDNA文庫并進行大規(guī)模測序，通過EST功能注釋、EST序列分析和cDNA芯片雜交，從組學水平系統(tǒng)分析非對稱體細胞雜交對SR3基因組的基因結構和基因表達的影響及其與SR3耐鹽能力的關系，為闡明非對稱雜交介導的基因組變異機制提供了理論基礎。
　　 一、SR3和JN177 cDNA文庫構建
　　 現(xiàn)在常用的文庫構建技術具有各自的優(yōu)缺點。根據課題研究目標，本試驗利用Stratagene技術構建了兩個噬菌體文

4、庫：SR3鹽脅迫根葉混合文庫和SR3旱脅迫根葉混合文庫；利用Gateway技術構建了兩個重組文庫：SR3鹽旱脅迫根混合文庫和JN177鹽旱脅追根混合文庫。四個cDNA文庫容量均達到107以上，插入片段的平均長度超過1.3kb，滿足大規(guī)模測序的需要，為系統(tǒng)分析非對稱雜交介導的基因組變異和深入開展小麥功能基因學研究提供了堅實的基礎。
　　 二、SR3和JN177 cDNA文庫的大規(guī)模測序和注釋
　　 利用5’端測序方法，獲得

5、了18192條SR3和9770條JN177的高質量5’端EST序列，總長度分別達到11678320 bp和7131983 bp。經CAP3軟件聚類分析，分別獲得了9634和7107條不重復的單一EST序列，其中contigs分別為2097和1207條，sigletons分別為7537和5900條，全長序列分別為4825條和2975條。利用本地BLAST軟件將這些單一EST序列和小麥EST數(shù)據庫進行比較，發(fā)現(xiàn)沒有比對結果的476條SR3序

6、列和594條JN177序列是新的小麥EST，而且部分SR3序列可能是來源于長穗偃麥草的外源序列。利用Blast2GO工具獲得的單一EST序列進行功能注釋和分類，發(fā)現(xiàn)在SR3 cDNA文庫中含有高豐度的抗逆和抗病相關EST。利用codonw軟件對SR3和JN177的密碼子使用偏愛性進行了分析，結果表明SR3和JN177 EST密碼子第三位GC含量分別為67.4％和69.7％，遠遠高于小麥基因整體序列的GC含量，而且SR3整體序列的GC含量

7、明顯低于JN177。
　　 三、SR3和JN177的EST序列多態(tài)性分析
　　 為了系統(tǒng)分析小麥品種間序列多態(tài)性和非對稱雜交介導的序列多態(tài)性，本試驗進行了三組比對分析：JN177 EST序列比對小麥EST數(shù)據庫(JN177-Ta)、SR3EST序列比對小麥EST數(shù)據庫(SR3-Ta)和SR3 EST序列比對JN177 EST序列(SR3-JN177)。然后從中提取相似性大于等于96％的序列進行多態(tài)性分析，其中SR3-JN

8、177有2581條，SR3-Ta有7284條，JN177-Ta有5072條。
　　 與Ta數(shù)據庫相比，JN177 EST序列的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotidepolymorphism，SNP)和1-22核苷酸插入/缺失(Insertion and Deletion，InDel)頻率分別為9.02 SNPs/kb EST和3.81 InDels/kb EST，SR3 EST序列的SNPs和InDels頻率分別為9

9、.09 SNPs/kb EST和4.29 InDels/kb EST；而與JN177相比，SR3 EST序列的SNPs和InDels頻率較高，分別為11.8 SNPs/kb EST和5.44 InDels/kb EST。這些結果表明非對稱體細胞雜交可以引起高頻率的基因組變異；SR3-Ta間的基因組多態(tài)性并非是非對稱體細胞雜交過程新產生的多態(tài)性和JN177-Ta間原有多態(tài)性的簡單疊加，暗示基因組變異可能存在可逆的恢復變異機制，而且SNPs

10、的恢復能力更強。
　　 結果發(fā)現(xiàn)，不同類型SNP和InDel的發(fā)生頻率具有不均衡的特點。與JN177-Ta和SR3-Ta相比，SR3-JN177中A→T和T→A在總SNPs中所占比例明顯降低，而C→T所占比例則顯著提高(16.6％：14.8％)。C→T的堿基替換主要通過甲基化C脫氨實現(xiàn)，顯示非對稱體細胞雜交顯著改變了SR3基因組的甲基化水平。SR3-Ta和JN177-Ta之間不同類型SNP所占比例也不相同，其中G→A頻率在SR3

11、-Ta SNPs中占17％，而在JN177-Ta只占14％，表明不同SNP的可逆性存在差異。SR3-JN177中單核苷酸Insertion頻率占單核苷酸InDel的62.0％，JN177-Ta中占74.6％，而SR3-Ta中占76.4％，表明Insertion和Deletion的不均衡性導致InDel的可逆性程度較低，而且非對稱體細胞雜交介導的Insertion和Deletion頻率的均衡性高于自然和異源多倍體進化。JN177-Ta和S

12、R3-Ta中大片段(>22bp)Deletion頻率高于Insertion頻率，表明異源六倍體小麥中的二倍體化是一直發(fā)生著的進化事件。但SR3-JN177中大片段Insertion頻率高于Deletion頻率，暗示非對稱體細胞雜交雜種和異源多倍體中“二倍化”的機制存在顯著差異。
　　 分析顯示，InDel相鄰核苷酸的GC含量具有特異性。JN177-Ta和SR3-Ta中Insertion左邊相鄰核苷酸GC含量很高而右邊相鄰核苷酸G

13、C含量很低，Deletion正好相反；在SR3-JN177中Insertion和Deletion均為左邊相鄰核苷酸GC含量較高，而右邊相鄰核苷酸GC含量較低。這說明InDel不是一種隨機的生物學事件，GC含量可能是InDel位點的識別特征，而且非對稱體細胞雜交雜種和異源多倍體中的識別機制存在差異。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)6-22nt InDel具有“3N”特征，即6、9、12、15、18和21nt InDel頻率及其側翼序列GC含量均高于相鄰

14、大小InDel，而且InDel頻率與側翼序列GC含量存在指數(shù)相關性，其中SR3-JN177中相關性最高。
　　 此外，SR3-JN177中有些InDel兩端具有重復序列的拷貝或者存在滑動現(xiàn)象，而且有些序列存在轉位和反向重復等特征，表明非對稱體細胞雜交能夠引起多樣化的基因組變異。
　　 四、SR3和JN177的cDNA芯片分析
　　 為了評估高頻率的基因組變異對轉錄組的影響以及SR3的耐逆分子基礎，我們利用cDNA

15、芯片比較了對照和鹽、旱脅迫下SR3和JN177幼苗根轉錄組差異。為了涵蓋部分漸滲到SR3中的長穗偃麥草序列，本試驗根據部分cDNA文庫序列和功能數(shù)據庫小麥EST拼接序列設計探針，點制了60-mer cDNA芯片，其包含15172個探針，代表小麥15000個unigene。
　　 對照條件下，共有508個探針的轉錄水平在SR3和JN177間存在顯著差異，其中在SR3中高表達的探針有241個，低表達的探針有267個。高表達探針中脅迫

16、響應過程的富集程度最高，包括冷調節(jié)蛋白、熱激蛋白和脫水素等。此外，戊糖磷酸和抗壞血酸鹽代謝以及一些茉莉酸和赤霉素合成和響應途徑基因表達顯著增強，而碳和能量代謝相關基因表達降低。
　　 NaCl處理0.5h后，SR3和JN177中上調表達的探針分別有122和87個，其中48個共同上調；下調表達的探針分別為101和218個，其中75個共同下調。PEG處理0.5h后，SR3和JN177中上調表達的探針分別為215和210個，下調表達的

17、探針分別為81和143個，其中同時上調和下調的探針分別為71和29個。NaCl處理24h后，SR3和JN177上調表達的探針分別為1451和1556個，下調表達的探針分別為1579和1507個，其中同時上調和下調的探針分別為950和978個。有趣的是，除了4個探針外，其他非共同響應的探針均表現(xiàn)出品種特異性的脅迫響應特征，即在脅迫條件下只在一個品種中表達發(fā)生變化，而在另一個品種中表達量保持不變。生物途徑聚類分析顯示，PEG和NaCl脅迫0

18、.5h后，SR3中非飽和脂肪酸和脂肪生物合成即α-亞麻酸代謝耐逆相關過程的活性顯著高于JN177；NaCl處理24h后，抗壞血酸代謝、糖酵解/糖異生、不飽和脂肪酸和類黃酮生物合成等耐逆相關過程在SR3中被顯著促進。這些途徑增強與G蛋白-磷脂-ABA/DREB信號通路活性以及激素合成和調控網絡的整體提升相關。
　　 將SR3與JN177 EST序列與芯片探針序列進行比對，具有匹配探針的EST序列分別有3471和1618條，但這些序

19、列豐度與匹配探針的雜交信號間沒有相關性。為了比較序列變異對基因表達的影響，我們從這些序列中提取出SR3和JN177同源且匹配探針表達變化的序列61條。上調表達探針匹配的序列共有17條，均具有SNPs，其中15條含有InDel，包括一個414bp的大片段InDel。下調表達探針匹配的序列有42條，其中39條具有SNPs，27條含有InDel。
　　 根據EST多態(tài)性分析和探針功能注釋結果，發(fā)現(xiàn)SR3和JN177間基因表達差異是以下

20、遺傳學和表觀遺傳學因素系統(tǒng)改變的結果：1、序列發(fā)生了高頻率的SNP和InDel變異；2、來源于供體親本長穗偃麥草的漸滲序列；3、逆轉錄轉座子和轉座子轉錄活性的改變；4、一系列組蛋白變體和組蛋白修飾相關基因表達模式的轉變導致染色體重塑；5、DNA甲基化模式的改變。
　　 綜上，通過對SR3和JN177 cDNA文庫的高通量測序、序列比較和cDNA芯片分析表明，非對稱體細胞雜交過程中基因組發(fā)生了有規(guī)律的高頻率序列變異和表達變異，從而