1、黃瓜是世界范圍內(nèi)的一種重要蔬菜。近年來,隨著設(shè)施栽培面積的不斷擴(kuò)大,黃瓜越來越成為我國溫室的主栽蔬菜作物之一。然而,由于溫室的特殊環(huán)境如高溫、高濕等,一些重要的病害嚴(yán)重地影響著黃瓜產(chǎn)品的產(chǎn)量和品質(zhì)。其中,由于霜霉病菌生理小種的變異,先前鑒定的抗病基因dm-,dm-2和dm-3已經(jīng)不能有效的防治該病害的發(fā)生,使得霜霉病(downy mildew)成為目前黃瓜生產(chǎn)上最重要的病害。因此,尋找新的抗性種質(zhì)資源培育抗病品種是防治該病害發(fā)生的最經(jīng)濟(jì)

2、、有效、安全的措施。
　　 黃瓜/酸黃瓜抗霜霉病漸滲系(5211s)是在黃瓜屬種間雜交(Cucumis hystrix×C.sativus)的基礎(chǔ)上,通過多代回交、自交選育獲得。在中國、美國和荷蘭等地進(jìn)行苗期和田間接種鑒定,5211S均表現(xiàn)對(duì)霜霉病有較高的抗性。為了加速此抗性種質(zhì)資源在黃瓜育種中的應(yīng)用,本文初步分離了5211S中抗病相關(guān)基因,評(píng)價(jià)了它們?cè)谏锩{迫和非生物脅迫條件下的表達(dá)情況,并且進(jìn)一步分析了這些抗病基因之間的進(jìn)化

3、關(guān)系,為黃瓜抗病育種奠定了基礎(chǔ)。此外,為了精確分析這些抗病基因的表達(dá)情況,我們運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)對(duì)黃瓜常用內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。
　　 具體結(jié)果如下:
　　 1、黃瓜常用內(nèi)參基因qRT-PCR表達(dá)穩(wěn)定性評(píng)價(jià)
　　 以黃/酸黃瓜抗霜霉病漸滲系5211S為材料,通過qRT-PCR技術(shù)結(jié)合生物學(xué)軟件(geNorm、NormFinder和BestKeeper)評(píng)價(jià)了十個(gè)常用的內(nèi)參基因在黃瓜

4、不同組織中以及生物脅迫和非生物脅迫條件下的表達(dá)穩(wěn)定性；不同組織包括根、莖和葉,生物脅迫主要為霜霉菌脅迫處理,非生物脅迫包括干旱、高鹽、低溫、高溫及其外源激素如ABA、SA、MeJA、H2O2處理?xiàng)l件。
　　 結(jié)果表明:在所有的12個(gè)黃瓜樣品中,內(nèi)參基因EF1α和UBI—ep表達(dá)較穩(wěn)定。在黃瓜不同組織中,除了內(nèi)參基因EF1α和UBI-ep外,TUA也表現(xiàn)較強(qiáng)的表達(dá)穩(wěn)定性。在不同激素處理?xiàng)l件下,內(nèi)參基因UBI-ep和TUA表現(xiàn)較強(qiáng)的

5、表達(dá)穩(wěn)定性。然而,在非生物脅迫處理?xiàng)l件下,僅僅內(nèi)參基因EF1α表現(xiàn)出比較強(qiáng)的穩(wěn)定性?？梢钥闯霾煌瑮l件下,內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性也不同；EF1α、UBI-ep和TUA最適合的內(nèi)參基因。因此,我們?cè)诜治瞿康幕虮磉_(dá)狀況時(shí),要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)條件選擇具體的內(nèi)參基因。
　　 2、黃瓜/酸黃瓜漸滲系NBS-LRR類型抗病基因的鑒定、特征及其與霜霉病相關(guān)基因的表達(dá)分析
　　 根據(jù)NBS—LRR類型抗病基因設(shè)計(jì)兼并引物,以黃瓜抗霜霉病漸滲

6、系5211S基因組DNA為模板,通過PCR技術(shù)分離與霜霉病相關(guān)的抗病同源基因(也稱為抗病基因同源序列)；運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)分析了這些抗病基因在5211S根、莖、葉及其在脅迫條件下的表達(dá)情況；并且進(jìn)一步分析了它們之間的進(jìn)化關(guān)系。
　　 結(jié)果表明:共分離獲得了28條NBS-LRR類型抗病基因同源序列,系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明這些抗病基因可以分為4類,分別屬于TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR兩大類抗病基因。進(jìn)化分析

7、表明,除少數(shù)幾個(gè)抗病基因經(jīng)歷“多樣化選擇”外,“純化選擇”在這些抗病基因進(jìn)化過程中起著重要的作用。qRT-PCR分析表明他們?cè)?211S根莖葉中是差異表達(dá)的；并且外源野生酸黃瓜的漸滲誘發(fā)了部分抗病基因的表達(dá)；其中,抗病同源基因CsRGA23的表達(dá)量比回交親本“北京截頭”增加了4倍。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),CsRGA23的表達(dá)能被霜霉菌及一些信號(hào)分子如MeJA,SA,ABA,和H2O2顯著地誘導(dǎo)。表明外源野生酸黃瓜DNA的漸滲誘發(fā)抗病基因同源序列

8、CsRGA23表達(dá)量的提高可能涉及到5211S對(duì)霜霉病的抗性形成。
　　 3、葫蘆科作物NBS-LRR類型抗病基因的比較聚類及分子進(jìn)化分析
　　 為了探明葫蘆科作物NBS-LRR類型抗病基因的進(jìn)化模式,我們從GenBank數(shù)據(jù)庫中搜索了78條抗病基因,進(jìn)行了他們之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析,這將對(duì)葫蘆科作物NBS-LRR類型抗病基因的起源提供了理論基礎(chǔ)。
　　 本文所用78條抗病基因主要來自于黃瓜(43條),甜瓜(14

9、條),南瓜(14條)和西瓜(7條)。系統(tǒng)進(jìn)化樹明顯地把他們分為兩個(gè)不同的分支,即TIR(Toll蛋白和白介素受體)分支和CC(在N端含有一個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)域的序列)分支,并且進(jìn)一步可以細(xì)分為四個(gè)亞分支(TIR1、TIR2、CC1和CC2)。我們發(fā)現(xiàn)在這四個(gè)亞分支中,只有TIR1分支表現(xiàn)為物種特異性擴(kuò)張(黃瓜)；其他三個(gè)亞分支都是由兩個(gè)或三個(gè)物種的序列組成,形成不均勻的分支；表明這些抗病基因在在葫蘆科作物分化后,在黃瓜中進(jìn)行了特異性擴(kuò)張。進(jìn)一步

10、與擬南芥抗病基因序列比較分析發(fā)現(xiàn),除了少數(shù)幾條序列外,絕大多數(shù)的葫蘆科作物抗病基因同源序列在系統(tǒng)進(jìn)化上與擬南芥不同。此外,序列分析還表明基因重復(fù)、序列差異和基因缺失在葫蘆科作物NBS-LRR類型抗病基因進(jìn)化中具有重要的作用。
　　 4、黃瓜/酸黃瓜漸滲系Pto型抗病基因的分離、進(jìn)化及表達(dá)分析
　　 本文通過PCR技術(shù)分離黃瓜/酸黃瓜漸滲系的Pto類型抗病同源基因,分析了這些同源基因之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,比較研究了他們與番茄

11、Pto(編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白,STK)抗病基因的結(jié)構(gòu)特征,進(jìn)一步分析了他們?cè)邳S瓜基因組中進(jìn)化方式。
　　 我們共獲得了18條STKs序列,系統(tǒng)發(fā)育分析這些序列分為8類。其中,6類屬于黃瓜Pto型抗性基因同源序列(Pto-RGAs)。氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)這些Pto—RGAs都具有番茄Pto抗病基因的典型特征；但也出現(xiàn)氨基酸的缺失和插入現(xiàn)象,如在第133、134位兩個(gè)氨基酸的缺失,第160、161、162位氨基酸的插入。另外,這些P

12、to—RGAs抗病基因之間的同義突變與非同義突變的比值(Ka/Ks)均小于1,表明了“純化選擇”在黃瓜/酸黃瓜漸滲系Pto類型抗病基因進(jìn)化過程中起到了重要的作用。
　　 5、黃瓜/酸黃瓜漸滲系類甜蛋白基因的克隆及表達(dá)分析
　　 運(yùn)用Tail-PCR技術(shù)從黃瓜/酸黃瓜抗霜霉病漸滲系中分離類甜蛋白(病程相關(guān)蛋白PR5同源基因)基因,qRTPCR技術(shù)分析了它在根莖葉的表達(dá)情況；并且進(jìn)一步評(píng)價(jià)它在生物脅迫和非生物脅迫條件下的表達(dá)

13、情況。
　　 結(jié)果表明,黃瓜/酸黃瓜抗霜霉病漸滲系類甜蛋白基因被命名為CsPR5,該基因長1504 bp,含有726 bp的開放閱讀框,編碼241個(gè)氨基酸殘基。BLAST搜索結(jié)果表明,該序列與其他物種的PR5同源基因有較高的同源性。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)它在根莖葉中是差異表達(dá)的；進(jìn)一步研究表明霜霉菌和一些外源信號(hào)物質(zhì)(SA,MeJA,ABA,和H2O2)能顯著了誘導(dǎo)CsPR5基因的表達(dá)。因此,CsPR5基因可能參與了5211S對(duì)