1、黃瓜是一種以嫩果為食用的大宗蔬菜。黃瓜屬于草本科蔓生植物，在生產(chǎn)中易受多種病原菌的侵染，使其產(chǎn)量和品質(zhì)受到嚴重影響。黃瓜霜霉病和棒孢葉斑病是黃瓜生產(chǎn)上的重要病害。病害傳播流行速度快，對黃瓜生產(chǎn)威脅極大。長期使用化學(xué)藥劑進行病害防治，已經(jīng)導(dǎo)致霜霉病菌和棒孢葉斑病菌產(chǎn)生抗藥性。同時大量的農(nóng)藥殘留會造成環(huán)境污染和危害人類健康等問題。綠色、經(jīng)濟有效的防治方法仍為選育及利用抗病品種。培育單一抗病品種已無法解決病害給黃瓜生產(chǎn)帶來的嚴重影響。國內(nèi)外對

2、黃瓜棒孢葉斑病的研究基礎(chǔ)比較薄弱，多集中在病原菌生理分化、抗藥性及抗性遺傳規(guī)律等方面，缺少系統(tǒng)的抗病機理方面的研究。黃瓜霜霉病的研究起步雖早，但抗性遺傳規(guī)律仍存在爭議，分子調(diào)控機理尚不明了。本研究從抗源篩選、組織病理學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和基因功能方面對黃瓜雙抗機制進行了研究。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴采用苗期人工接種鑒定法，對50份黃瓜種質(zhì)資源進行霜霉病和棒孢葉斑病抗病性鑒定。結(jié)果表明，無高抗霜霉病材料，抗霜霉病材料有11份;高抗棒孢葉

3、斑病材料有9份。通過對50份材料雙抗性比較，抗2種病害材料共有5份，品種編號分別為16號（歐洲鮮用型）、28號（腌漬型）、31號（華北型）、38號（華南型）和50號（華南型），占總數(shù)的10％。在4種生態(tài)類型中，華南型黃瓜雙抗性最好;篩選獲得雙抗材料（38號）和雙感材料（6號）用于后續(xù)研究。⑵利用光學(xué)顯微鏡觀察霜霉病菌侵染抗感黃瓜品種的侵染過程，結(jié)果表明霜霉病菌通過游動孢子萌發(fā)產(chǎn)生芽管進行侵染，侵染進程在抗感黃瓜品種上沒有差異;接種24

4、h芽管可從氣孔侵入黃瓜葉片組織。采用離體接種和臺盼藍染色觀察HR發(fā)生情況，結(jié)果表明抗病品種D9320接種36 h，顯微鏡下觀察到HR現(xiàn)象，接種4d產(chǎn)生肉眼可見壞死斑;感病品種D0401接種5d，顯微鏡下觀察到微弱的HR現(xiàn)象，但并無肉眼可見壞死斑產(chǎn)生;接種5d，抗病品種D9320上菌絲蔓延量明顯少于感病品種D0401。HR的發(fā)生對霜霉病菌的侵染起到了抑制作用。⑶利用光學(xué)顯微鏡及掃描電鏡對棒孢葉斑病菌侵染抗感黃瓜品種過程進行觀察，結(jié)果表明侵

5、染進程在抗感品種中沒有差別。棒孢葉斑病菌通過分生孢子萌發(fā)產(chǎn)生芽管進行侵染，24 h芽管可直接侵入或從氣孔侵入黃瓜葉片組織。采用離體接種和臺盼藍染色觀察HR，結(jié)果顯示抗病品種D9320接種24 h，顯微鏡下觀察到HR現(xiàn)象，接種4d產(chǎn)生肉眼可見壞死斑;感病品種D0401接種5d，顯微鏡下觀察到微弱的HR現(xiàn)象，但并無肉眼可見壞死斑產(chǎn)生。接種5d，抗病品種D9320上菌絲蔓延量明顯少于感病品種D0401。HR的發(fā)生對棒孢葉斑病菌的侵染起到了抑制

6、作用。⑷采用DAB、TB和AB染色，顯微觀察H2O2、木質(zhì)素和胼胝質(zhì)的積累。觀察結(jié)果顯示，接種霜霉病菌和棒孢葉斑病菌后三者的積累模式一致，抗病品種D9320中的積累均早且高于感病品種D0401;不同點在于抗病品種D9320接種棒孢葉斑病菌后三者的積累稍早于接種霜霉病菌后的積累。⑸利用轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）技術(shù)和比較基因組學(xué)的方法對不同病原菌脅迫下的差異表達基因進行分析，共得到45個在抗病品種中上調(diào)，感病品種中下調(diào)或非差異的基因。根

7、據(jù)基因注釋結(jié)果，篩選到與植物抗病性關(guān)系密切的10個基因，分別為果膠裂解酶基因、蛋白激酶家族基因、BAG家族基因、CBS結(jié)構(gòu)域蛋白基因、赤霉素調(diào)節(jié)蛋白基因、ERF轉(zhuǎn)錄因子、bHLH157轉(zhuǎn)錄因子、鋅指蛋白基因、鈣調(diào)素蛋白基因和CCT基序蛋白基因。其中ERF轉(zhuǎn)錄因子在植物抗病反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中具有重要作用，篩選進行功能分析。⑹在不同病原菌脅迫下，對抗病品種D9320和感病品種D0401中差異表達基因進行pathway顯著性富集分析，結(jié)果顯示抗

8、感品種中共有的代謝通路為19個。差異基因所占比例較高且與植物抗病性關(guān)系密切的pathway有植物病原菌互作苯丙氨酸代謝、類黃酮生物合成和次生代謝產(chǎn)物的生物合成。⑺利用PCR技術(shù)克隆了黃瓜CsERF004基因，并對其進行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明CsERF004基因編碼蛋白具有1個AP2結(jié)構(gòu)域，屬于ERF亞組中B-6類蛋白;啟動子序列預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，具有防御及應(yīng)激反應(yīng)元件、真菌激發(fā)子響應(yīng)元件、乙烯應(yīng)答元件和水楊酸響應(yīng)元件等多個反應(yīng)調(diào)控元件，推

9、測黃瓜CsERF004基因表達可能與黃瓜抗病性相關(guān)。⑻利用qRT-PCR技術(shù)分析黃瓜CsERF004基因在不同病原菌脅迫下的表達模式。結(jié)果顯示接種棒孢葉斑病菌、霜霉病菌及同時接種2種病原菌的3種處理下，CsERF004在抗病品種D9320中呈現(xiàn)特異表達模式，即在病原菌脅迫下從2h到96 h呈顯著上調(diào)表達，96 h到達高峰之后開始下降，整體呈拋物線變化趨勢;而在感病品種D0401中，其表達量很低且?guī)缀鯚o變化，僅相當于D9320中2h的表達

10、水平，從2h到120 h的表達量呈直線形。結(jié)果顯示CsERF004積極響應(yīng)霜霉病菌和棒孢葉斑病菌的脅迫，可能對2種病原菌的侵染具有一定抵抗能力，并參與黃瓜雙抗性的抗病反應(yīng)。⑼利用qRT-PCR技術(shù)分析黃瓜CsERF004基因在不同激素誘導(dǎo)下的表達模式。結(jié)果顯示黃瓜CsERF004基因能夠在水楊酸和乙烯的誘導(dǎo)下上調(diào)表達，不能被茉莉酸誘導(dǎo)表達。⑽成功構(gòu)建CsERF004基因與綠色熒光蛋白(GFP)的融合表達載體，通過綠色熒光蛋白(GFP)瞬