1、黃瓜(Cucumis sativus L.)是國(guó)際上第3大蔬菜作物。由Pseudoperonosporacubensis(Berk.et Curt.)Rostow.專性寄生菌引起的霜霉病是瓜類蔬菜生產(chǎn)中一種最具毀滅性的世界性病害,給黃瓜生產(chǎn)造成了非常嚴(yán)重的損失,因此黃瓜霜霉病的防治一直為研究者和生產(chǎn)者所關(guān)注。實(shí)踐證明,培育抗病品種是最經(jīng)濟(jì)、環(huán)保、高效的途徑,而了解和掌握黃瓜霜霉病抗病機(jī)制,是尋找培育高效、穩(wěn)定抗病品種新方法的必由之路。從

2、基因表達(dá)整體水平上了解抗病相關(guān)基因表達(dá)的種類與數(shù)量,分析其相互關(guān)系,進(jìn)而研究寄主抗病基因與病原菌的互作,是進(jìn)行抗病機(jī)制研究的有效方法然而,到目前為止,有關(guān)黃瓜霜霉病抗性遺傳規(guī)律存在爭(zhēng)議,黃瓜霜霉病抗性基因調(diào)控機(jī)制知之甚少。因此,本研究首先評(píng)價(jià)了42個(gè)黃瓜品種(自交系)霜霉病抗性,篩選出高抗霜霉病的黃瓜自交系,選用抑制差減雜交方法(suppressionsubtractive hybridization,SSH)構(gòu)建差減文庫,應(yīng)用反向No

3、rthern高通量篩選技術(shù)篩選出差異表達(dá)片段,通過序列和生物信息學(xué)分析,確定參與抗病反應(yīng)的基因數(shù)量和功能類別,從形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)以及抗病相關(guān)基因的表達(dá)分析等方面,初步研究了黃瓜抗病自交系與病原菌的互作,為揭示復(fù)雜的抗病防御反應(yīng)分子機(jī)理,確定更有效的抗病育種途徑,創(chuàng)建穩(wěn)定的抗性材料提供基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.選擇有代表性或大面積種植的42個(gè)品種(自交系)為材料,采用苗期噴霧接種和成株期田間自然感病的方法,進(jìn)行3次獨(dú)立試驗(yàn)

4、,對(duì)上述試材霜霉病抗性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同品種(自交系)對(duì)霜霉病的抗性存在較大差異。病情指數(shù)小于2.5為高抗霜霉病的材料,包括IL57、IL102、津春4號(hào)、農(nóng)城4號(hào)、中農(nóng)8號(hào)、園豐6號(hào)等,這些品種或自交系均屬華北類型,其中IL57平均病情指數(shù)最小,抗性最強(qiáng)。病情指數(shù)大于6為感霜霉病類型,包括IL101、IL112、津優(yōu)3號(hào)、津優(yōu)30號(hào)、新世紀(jì)和長(zhǎng)春密刺等,其中IL112平均病情指數(shù)最大,抗病性最弱。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),黃瓜成株期霜霉

5、病病情指數(shù)在不同試驗(yàn)間呈極顯著相關(guān),苗期與成株期的病情指數(shù)也呈極顯著相關(guān),證明苗期抗病性與成株期抗病性一致。因此,選擇高抗自交系IL57和感病自交系IL112為后續(xù)研究材料。
　　 2.以高抗自交系IL57經(jīng)霜霉病菌接種32、48、56 h后和接種清水對(duì)照的葉片為材料,采用SSH技術(shù)構(gòu)建了富集黃瓜霜霉病抗性相關(guān)基因的正、反向差減文庫。應(yīng)用反向Northern斑點(diǎn)雜交技術(shù)進(jìn)行篩選,從正、反向差減文庫中分別得到了60和26個(gè)非重復(fù)序

6、列片段(singleton ESTs)。其中,正向差減文庫的singleton ESTs涉及12種功能類別和未知功能。按所占比例大小依次為:未知功能、蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞運(yùn)輸、初級(jí)代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞防御、能量代謝、蛋白質(zhì)降解、結(jié)合功能蛋白、信號(hào)傳導(dǎo)、次級(jí)代謝、細(xì)胞周期和DNA加工等。這些功能基因幾乎涉及了植物防御病原菌侵染的全部反應(yīng)過程。反向文庫的非重復(fù)序列片段涉及9種功能和未知功能,即能量代謝、次級(jí)代謝、細(xì)胞防御、結(jié)合功能蛋白、初級(jí)代謝

7、、蛋白質(zhì)合成、蛋白質(zhì)降解、細(xì)胞運(yùn)輸、信號(hào)傳導(dǎo)和未知功能等。在病原菌誘導(dǎo)下,下調(diào)基因的篩選將為研究黃瓜防御機(jī)制提供更全面的信息。
　　 在全部86個(gè)顯著表達(dá)的ESTs中,60個(gè)來源于正向差減文庫,占顯著表達(dá)ESTs總數(shù)的70％,下調(diào)特異表達(dá)的ESTs僅有30％。比較分析發(fā)現(xiàn),與正向差減文庫相比,反向差減文庫中有更多的次級(jí)代謝和能量代謝相關(guān)基因下調(diào)顯著,表明在霜霉病病原菌脅迫下,黃瓜參與次級(jí)代謝和能量代謝基因的表達(dá)更多地受到了抑制或

8、破壞。
　　 3.根據(jù)上述研究結(jié)果,選用黃瓜霜霉病的高抗自交系IL57和感病自交系IL112作為黃瓜與病原菌互作研究的試材,采用黃瓜苗期注射接種、噴霧接種以及田間自然感病等方法,觀察黃瓜霜霉病病情發(fā)展和病斑的形成。觀察發(fā)現(xiàn),無論采用何種接種方法,感病自交系IL112感染霜霉病后,病斑呈水浸狀、淺綠色。隨后病斑面積彌散型急劇擴(kuò)大,水浸狀病斑逐漸失綠。感病后期,水浸狀病斑逐漸腐爛。高抗自交系IL57感染霜霉病初期,侵染部位呈水浸狀、

9、淺綠色病斑。隨著病情的進(jìn)一步發(fā)展,病斑逐漸擴(kuò)大、失綠,質(zhì)地變成膜狀；菌絲不能穿過葉脈,病斑呈多角型,成熟病斑面積不再擴(kuò)大,病斑中央穿孔,呈膜狀壞死,形成了典型的過敏性病斑。
　　 細(xì)胞組織化學(xué)研究發(fā)現(xiàn),霜霉病侵染黃瓜高抗自交系IL57后,抗病寄主在感病葉片侵染點(diǎn)周圍很快產(chǎn)生了大量的H2O2。伴隨過敏性反應(yīng)的發(fā)生,侵染點(diǎn)和細(xì)胞壁周圍沉積了大量胼胝質(zhì)和木質(zhì)素。因此,黃瓜抗病自交系與霜霉病互作會(huì)發(fā)生非親和反應(yīng),迅速形成過敏性病斑,阻礙

10、病情的進(jìn)一步發(fā)展。
　　 應(yīng)用qRT-PCR技術(shù),比較了34個(gè)ESTs在非親和反應(yīng)和親和反應(yīng)中的表達(dá)模式。結(jié)果表明,抗病相關(guān)基因在非親和反應(yīng)和親和反應(yīng)中存在差異,大部分抗病相關(guān)基因在非親和反應(yīng)中早期特異表達(dá)或表達(dá)豐度特異增高。初步推測(cè),在黃瓜與霜霉病的過敏性反應(yīng)中,可能通過多胺代謝途徑生成了H2O2,G蛋白作為信號(hào)分子,也許部分調(diào)控了H2O2的生成和細(xì)胞程序性死亡。與此同時(shí),超氧化物歧化酶(superoxide dismutas

11、e,SOD)、2-型金屬硫蛋白、肌醇半乳糖苷和半乳糖苷系列寡糖(raffmose family oligosaccharides,RFOs)或許作為活性氧清除機(jī)制的重要成分,保護(hù)細(xì)胞不受過量活性氧的危害。H2O2可能與木質(zhì)素氧化交聯(lián),激活β-半乳糖苷酶和延伸因子1-alpha基因的表達(dá),導(dǎo)致細(xì)胞壁的重排和加厚。泛素-蛋白酶體途徑可能參與過敏性反應(yīng)。此外,轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞防御、植保素合成等信號(hào)傳導(dǎo)和整合,可能最終介導(dǎo)了黃瓜抵御霜霉病的抗病反