1、研究背景：
　　叉頭框轉(zhuǎn)錄因子F2（forkhead box F2，F(xiàn)OXF2）屬于間質(zhì)特異性轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞極性維持組織穩(wěn)態(tài)，在胚胎發(fā)育和組織分化過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXF2在基底細(xì)胞樣乳腺癌（basal-like breast cancer，BLBC）中特異性表達(dá)；FOXF2低表達(dá)通過(guò)誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）而促進(jìn)BLBC轉(zhuǎn)移

2、，但卻抑制癌細(xì)胞增殖。多項(xiàng)研究證實(shí)FOXF2在其他腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中也發(fā)揮著重要作用，但是調(diào)控腫瘤中FOXF2特異性表達(dá)的分子機(jī)制未見(jiàn)報(bào)道。我們通過(guò)生物信息學(xué)分析FOXF2近端啟動(dòng)子的DNA序列，發(fā)現(xiàn)其啟動(dòng)子上存在一個(gè)CpG島，且CpG島中存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子SP1的潛在結(jié)合位點(diǎn)。因此，我們推測(cè)DNA甲基化和轉(zhuǎn)錄因子SP1協(xié)同調(diào)節(jié)FOXF2在不同乳腺癌細(xì)胞亞型中表達(dá)及其在乳腺癌增殖和轉(zhuǎn)移中的作用。
　　目的：
　　本研究旨在闡明

3、DNA甲基化通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄因子SP1與FOXF2啟動(dòng)子的結(jié)合而調(diào)控 FOXF2在不同乳腺癌細(xì)胞亞型中表達(dá)的分子機(jī)制，以及其在 FOXF2介導(dǎo)的SP1調(diào)控乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和增殖中的作用。
　　研究方法：
　　1、采用亞硫酸氫鹽測(cè)序PCR（bisulfite sequencing PCR，BSP）方法檢測(cè)luminal亞型乳腺癌細(xì)胞系 MCF-7和MDA-MB-453、basal-like亞型乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和永生化

4、乳腺上皮細(xì)胞系 MCF-10A、以及20例乳腺原發(fā)癌組織中FOXF2啟動(dòng)子區(qū)的甲基化程度。同時(shí)，采用RT-QPCR方法檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞系和乳腺癌組織中FOXF2 mRNA的表達(dá)水平，Western blot方法檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞中FOXF2蛋白的表達(dá)水平。分析FOXF2啟動(dòng)子的甲基化程度與其表達(dá)水平的相關(guān)性。
　　2、為了研究DNA甲基化對(duì)FOXF2表達(dá)的影響，分別用濃度梯度為0、0.5、1、1.5、2和2.5μM的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制

5、劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷（5-Aza-2'-deoxycytidine，5-aza-dC）作用于乳腺癌細(xì)胞，然后通過(guò)RT-QPCR和Western blot方法檢測(cè)FOXF2表達(dá)水平的改變。
　　3、為了研究細(xì)胞內(nèi)甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）對(duì) FOXF2表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，分別采用小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）沉默F(xiàn)OXF2啟動(dòng)子高甲基化的MCF-

6、7和MDA-MB-453細(xì)胞中DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的表達(dá)，然后通過(guò)RT-QPCR和Western blot方法檢測(cè)FOXF2表達(dá)的變化。同時(shí)，通過(guò)染色質(zhì)免疫沉淀（chromatin immunoprecitation，ChIP）實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證MCF-7和MDA-MB-453細(xì)胞中DNMT1、DNMT3A、DNMT3B與甲基化的FOXF2啟動(dòng)子的結(jié)合。
　　4、為了研究DNA甲基化是否可以直接抑制FOXF2啟動(dòng)子的活性，

7、分別用甲基轉(zhuǎn)移酶SssI，HhaI和HpaII體外催化FOXF2啟動(dòng)子–655 bp至+128 bp的區(qū)域發(fā)生不同程度的甲基化修飾，然后克隆入 pGL3-basic載體，并轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞，最后采用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)不同甲基化程度的FOXF2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。
　　5、分別采用ChIP和雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證SP1對(duì)FOXF2啟動(dòng)子的結(jié)合和轉(zhuǎn)錄激活作用；為了分析 SP1對(duì) FOXF2表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，在MDA-M

8、B-231和MCF-10A細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染SP1真核表達(dá)載體（SP1）或SP1 siRNA（siSP1），以及采用SP1特異性抑制劑光輝霉素（Mithramycin，MTM）處理MDA-MB-231和MCF-10A細(xì)胞，然后通過(guò)RT-QPCR和Western blot方法檢測(cè)FOXF2表達(dá)的變化。
　　6、為了研究DNA甲基化對(duì)SP1轉(zhuǎn)錄激活FOXF2啟動(dòng)子活性的影響，用2μM的5-aza-dC處理MCF-7細(xì)胞，然后通過(guò)ChIP實(shí)

9、驗(yàn)檢測(cè)SP1與FOXF2啟動(dòng)子的結(jié)合能力的變化；SP1與不同甲基化狀態(tài)的FOXF2啟動(dòng)子熒光報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染MDA-MB-231后，采用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)SP1對(duì)不同甲基化程度的FOXF2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活作用。
　　7、為了研究FOXF2介導(dǎo)SP1對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控作用，分別在過(guò)表達(dá) SP1的MDA-MB-231細(xì)胞中降表達(dá) FOXF2，或在降表達(dá) SP1的MCF-10A細(xì)胞中過(guò)表達(dá)FOXF2，然后通過(guò)體外Transw

10、ell和MTT實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的改變，并采用Western blot方法檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞中SP1、FOXF2和FOXF2靶基因TWIST1的表達(dá)。
　　8、為了研究 SP1-FOXF2通路對(duì)不同亞型乳腺癌轉(zhuǎn)移的影響，我們基于 GEO（gene expression omnibus）基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)中一組427例乳腺癌患者的數(shù)據(jù)資料（登記號(hào)GSE25066），分別統(tǒng)計(jì)分析luminal亞型和Basal-like亞型乳腺癌患者

11、中SP1（probe set No.214732_at）和FOXF2（probe set No.206377_at） mRNA的表達(dá)水平與無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存（distant metastasis free survival，DMFS）的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1、Basal-like亞型的MDA-MB-231和MCF-10A細(xì)胞中，F(xiàn)OXF2啟動(dòng)子的甲基化程度低于luminal亞型的MCF-7和MDA-MB-453細(xì)胞，而MDA

12、-MB-231和MCF-10A細(xì)胞中 FOXF2 mRNA和蛋白表達(dá)水平高于 MCF-7和MDA-MB-453細(xì)胞?；贔OXF2 mRNA水平將20例乳腺癌組織分為FOXF2高表達(dá)組（FOXF2high；n=10）和FOXF2低表達(dá)組（FOXF2low；n=10），F(xiàn)OXF2high組中 FOXF2啟動(dòng)子的甲基化程度顯著低于 FOXF2low組（P=0.027）。證實(shí)乳腺癌中FOXF2啟動(dòng)子的甲基化程度與其表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。
　

13、　2、在5-aza-dC處理的MCF-7和MDA-MB-453細(xì)胞中，F(xiàn)OXF2啟動(dòng)子的甲基化程度顯著降低，F(xiàn)OXF2的表達(dá)水平隨著5-aza-dC濃度的增加而升高；在5-aza-dC處理的MDA-MB-231和MCF-10A細(xì)胞中，F(xiàn)OXF2的表達(dá)水平無(wú)明顯變化。證實(shí)乳腺癌中FOXF2啟動(dòng)子的甲基化是抑制其表達(dá)的重要因素。
　　3、在MCF-7細(xì)胞中降表達(dá)DNMT1或DNMT3A可以上調(diào)FOXF2表達(dá)水平，而降表達(dá)DNMT3B對(duì)

14、其表達(dá)水平?jīng)]有影響；在MDA-MB-453細(xì)胞中降表達(dá)DNMT1或DNMT3B可以上調(diào)FOXF2表達(dá)水平，而降表達(dá)DNMT3A對(duì)其表達(dá)水平?jīng)]有影響。ChIP實(shí)驗(yàn)證明MCF-7細(xì)胞中DNMT1和DNMT3A與FOXF2啟動(dòng)子的CpG島結(jié)合，而DNMT3B的結(jié)合十分微弱；MDA-MB-453細(xì)胞中DNMT1和DNMT3A與FOXF2啟動(dòng)子的CpG島結(jié)合，而DNMT3B的結(jié)合十分微弱。證實(shí)不同的乳腺癌細(xì)胞系中 DNMTs對(duì) FOXF2的表達(dá)抑

15、制作用不同。
　　4、雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)結(jié)果顯示，沒(méi)有甲基化的FOXF2啟動(dòng)子活性最高，甲基轉(zhuǎn)移酶HhaI和HpaII催化的部分甲基化的FOXF2啟動(dòng)子活性次之，而甲基轉(zhuǎn)移酶 SssI催化的完全甲基化的FOXF2啟動(dòng)子的活性最低。證實(shí) DNA甲基化可以直接抑制FOXF2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。
　　5、ChIP實(shí)驗(yàn)證明SP1可以與FOXF2啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合；雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)證實(shí)SP1可以增強(qiáng) FOXF2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性；在 FOXF

16、2啟動(dòng)子低甲基化的MDA-MB-231和MCF-10A細(xì)胞中分別降表達(dá)或過(guò)表達(dá)SP1，F(xiàn)OXF2的表達(dá)也隨之降低或升高；MTM處理MDA-MB-231和MCF-10A細(xì)胞后，F(xiàn)OXF2的表達(dá)水平隨著MTM濃度的升高而降低。證實(shí)SP1轉(zhuǎn)錄促進(jìn)FOXF2啟動(dòng)子低甲基化的乳腺癌細(xì)胞中FOXF2的表達(dá)。
　　6、5-aza-dC處理MCF-7細(xì)胞后，ChIP實(shí)驗(yàn)證明SP1與FOXF2啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合能力增強(qiáng)。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)

17、 SP1對(duì)完全甲基化的FOXF2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性沒(méi)有影響，但可以增強(qiáng)無(wú)甲基化和部分甲基化的FOXF2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。證實(shí)DNA甲基化抑制SP1對(duì) FOXF2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活。
　　7、過(guò)表達(dá) SP1可以降低 MDA-MB-231細(xì)胞的遷移和侵襲能力，下調(diào) FOXF2的靶基因TWIST1的表達(dá)水平，但增強(qiáng)細(xì)胞增殖能力，而降表達(dá)FOXF2可以逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá) SP1所導(dǎo)致的細(xì)胞生物學(xué)行為的改變；降表達(dá) SP1可以增強(qiáng)MCF-10A細(xì)胞的遷

18、移和侵襲能力，上調(diào)TWIST1的表達(dá)水平，但降低細(xì)胞增殖能力，而過(guò)表達(dá)FOXF2可以逆轉(zhuǎn)降表達(dá)SP1所導(dǎo)致的細(xì)胞生物學(xué)行為的改變。證實(shí)FOXF2介導(dǎo)SP1對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控作用。
　　8、根據(jù)FOXF2和SP1 mRNA的表達(dá)水平將427例病人分為SP1high/FOXF2high組(n=111)，SP1low/FOXF2high組(n=65)，SP1high/FOXF2low組(n=154)和SP1low/FOXF2l

19、ow組(n=97)。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，在basal-like亞型的乳腺癌患者中 SP1low/FOXF2low組患者的無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存率比其他三組患者低（P=0.0018），在luminal亞型的乳腺癌患者中四組患者的無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存率沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。證實(shí)SP1-FOXF2通路參與basal-like亞型乳腺癌的轉(zhuǎn)移，而與luminal亞型乳腺癌的轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1、在乳腺癌中，DNA甲基化調(diào)