1、芽孢桿菌（Bacillus）是革蘭氏陽(yáng)性菌，不含內(nèi)毒素，能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)分泌到胞外，是多種重要工業(yè)酶的生產(chǎn)菌株。隨著分子生物學(xué)和基因工程的迅速發(fā)展，芽孢桿菌作為基因表達(dá)系統(tǒng)得以不斷完善，并展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。本研究旨在建立和優(yōu)化枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）表達(dá)系統(tǒng)，對(duì)工業(yè)用野生型芽孢桿菌的遺傳操作系統(tǒng)進(jìn)行改良，以進(jìn)一步提高工程菌株的表達(dá)量，并建立具有應(yīng)用潛力的芽孢桿菌高效表達(dá)體系。
　　本文首先對(duì)枯草芽孢桿菌表

2、達(dá)系統(tǒng)載體進(jìn)行建立及優(yōu)化，其中包括含有不同啟動(dòng)子的表達(dá)載體（如：組成型啟動(dòng)子P43、乳糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Pgrac、木糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Pxyl、淀粉酶啟動(dòng)子PamyQ）、含有不同篩選標(biāo)記的克隆載體（如：卡那霉素Kan、紅霉素Em、氯霉素Cm、四環(huán)素Tet）、以及含不同整合位點(diǎn)的整合載體的構(gòu)建；其次對(duì)枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行優(yōu)化，有效的提高了遺傳轉(zhuǎn)化效率，從而建立了一套完善的枯草芽孢桿菌表達(dá)技術(shù)，為外源基因的高效分泌和表達(dá)提供平臺(tái)。利用該表達(dá)體

3、系，實(shí)現(xiàn)了氨肽酶基因 lapB在枯草芽孢桿菌中的高效表達(dá)，其搖瓶水平上的酶活達(dá)到了58.8 U/mL。
　　通過(guò)菌種改良獲得了能夠進(jìn)行內(nèi)源性 BamHI甲基化修飾的枯草芽孢桿菌菌株，通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的甲基化修飾，以及感受態(tài)制備條件的摸索，建立了中溫α-淀粉酶工業(yè)生產(chǎn)菌株解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens BF.7658的遺傳轉(zhuǎn)化方法。以該高效分泌淀粉酶的菌株為宿主菌，實(shí)現(xiàn)了堿性蛋白酶基因的高效異源分泌

4、表達(dá)，重組解淀粉芽孢桿菌工程菌株 AprEA在搖瓶培養(yǎng)72小時(shí)的分泌表達(dá)水平可達(dá)7800 U/mL，具有較好的應(yīng)用潛力。
　　解淀粉芽孢桿菌K11是本研究室保存的一株能高效分泌中性蛋白酶的野生型菌株，在搖瓶水平上其中性蛋白酶分泌水平可達(dá)到2700 U/mL。為進(jìn)一步提高其中性蛋白酶的表達(dá)水平，本研究克隆了解淀粉芽孢桿菌K11的中性蛋白酶基因K11npr，并構(gòu)建了游離型表達(dá)載體pKan300-K11npr和pUB110-K11npr

5、。將多拷貝的游離型重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化K11菌株后獲得解淀粉芽孢桿菌重組菌F20和110N-6。重組菌F20和110N-6在牛奶初篩平板上的蛋白酶活性明顯要高于野生型菌株K11。通過(guò)發(fā)酵條件優(yōu)化，重組菌110N-6在搖瓶水平上的酶活力可達(dá)到8995 U/mL，比野生型菌株提高了2倍多，在15升發(fā)酵罐的酶活力可達(dá)到24,000-28,000 U/mL，是目前已報(bào)道表達(dá)水平最高的中性蛋白酶。
　　重組表達(dá)質(zhì)粒的不穩(wěn)定性很大程度上限制了含高拷貝

6、游離質(zhì)粒的重組芽孢桿菌的廣泛應(yīng)用。本研究所構(gòu)建的兩個(gè)游離型表達(dá)載體 pKan300-K11npr和 pUB110-K11npr，其最大的差異是前者含有能在大腸桿菌中復(fù)制的pBR322-ori復(fù)制元件，而后者中只含有芽孢桿菌復(fù)制元件。對(duì)重組菌的遺傳穩(wěn)定性分析結(jié)果表明：重組菌F20的遺傳穩(wěn)定性遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如重組菌110N-6，在無(wú)選擇壓力的培養(yǎng)基上連續(xù)傳代，重組菌F20傳至第八代后質(zhì)粒即全部丟失，而重組菌110N-6傳至一百代，質(zhì)粒穩(wěn)定性仍保持在

7、90％以上。推測(cè)表達(dá)載體中同時(shí)含有兩種不同的復(fù)制元件可能是質(zhì)粒在芽孢桿菌中不穩(wěn)定的重要原因之一。本研究所構(gòu)建的重組質(zhì)粒pUB110-K11npr在菌株110N-6中非常穩(wěn)定，可以滿足工業(yè)化大生產(chǎn)要求。
　　枯草芽孢菌株AS.1398是經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期誘變獲得的表達(dá)中性蛋白酶的商業(yè)菌株。通過(guò)研究不同濃度的氨芐青霉素對(duì)菌株細(xì)胞壁合成的抑制作用，建立了AS.1398菌株的遺傳轉(zhuǎn)化方法。將重組表達(dá)載體pUB110-K11npr導(dǎo)入AS.1398菌