1、目的:腎臟纖維化(renal fibrosis，RF)是所有慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)進(jìn)展的共同病理表現(xiàn)。腎臟纖維化發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中局部炎癥反應(yīng)的形成、炎癥介質(zhì)釋放、腎臟固有細(xì)胞（包括系膜細(xì)胞、足細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞等）活化和凋亡（或壞死）、胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)堆積是導(dǎo)致腎臟結(jié)構(gòu)毀損的共同關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前腎臟纖維化診斷主要依賴腎穿刺活檢這一有創(chuàng)性檢

2、查手段，臨床上尚缺乏無(wú)創(chuàng)性檢查方法。近年來，尿沉渣細(xì)胞及其分子生物學(xué)信息檢測(cè)技術(shù)日益成熟，可能為探索腎臟纖維化相關(guān)生物標(biāo)志物提供嶄新的無(wú)創(chuàng)技術(shù)平臺(tái)。因此，本研究目的在于:基于尿液mRNA檢測(cè)技術(shù)，構(gòu)建可同時(shí)檢測(cè)多種尿液mRNA水平的腎臟纖維化靶向熒光定量PCR(polymerasechain reaction)芯片，發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證CKD患者腎臟纖維化相關(guān)生物標(biāo)志物，并對(duì)IgA腎病(IgA nephropathy, IgAN)患者腎臟纖維化進(jìn)

3、行聯(lián)合生物標(biāo)志物研究。
　　方法:
　　1.基于尿沉渣細(xì)胞mRNA檢測(cè)技術(shù)，選出86種腎臟纖維化可能相關(guān)基因并構(gòu)建靶向表達(dá)譜PCR芯片。選取50例經(jīng)腎臟活檢證實(shí)的CKD患者，利用所構(gòu)建的real-time PCR芯片進(jìn)行尿沉渣mRNA檢測(cè)評(píng)估，分析芯片的靈敏度、特異度和可重復(fù)性分析。
　　2.選取在東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院住院治療的135例經(jīng)腎臟活檢證實(shí)的CKD患者和31例健康對(duì)照(healthy control，HC)，

4、分為篩查組和驗(yàn)證組。使用所構(gòu)建的腎臟纖維化靶向熒光定量PCR芯片檢測(cè)尿沉渣細(xì)胞mRNA表達(dá)水平，分析目標(biāo)基因在CKD患者和健康對(duì)照之間的表達(dá)差異，并與血肌酐（serumcreatinine，Scr），尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)，腎小球?yàn)V過率(estimateglomerular filtration rate，eGFR)，腎小球硬化(glomerular sclerosis, GS)積分和小管間質(zhì)纖維化(t

5、ubular interstitial fibrosis，TIF)積分進(jìn)行相關(guān)性分析，篩選出腎臟纖維化的生物標(biāo)志物并在另一組CKD患者中進(jìn)行驗(yàn)證，評(píng)價(jià)芯片所篩選的基因?qū)δI臟纖維化的診斷價(jià)值。
　　3.選取在東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院住院治療的74例經(jīng)腎臟活檢證實(shí)的IgA腎病患者和31例健康對(duì)照。構(gòu)建由90個(gè)IgA腎病發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因組成的IgA腎病靶向表達(dá)譜PCR芯片并通過芯片檢測(cè)IgA腎病患者和健康對(duì)照的尿液mRNA，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因

6、，并與腎功能指標(biāo)、牛津分級(jí)(Oxford classification)、纖維化評(píng)分等相關(guān)性分析，篩選出IgA腎病腎臟纖維化相關(guān)候選基因標(biāo)志物。利用線性判別分析（Fisher's linear discriminant analysis）對(duì)候選基因構(gòu)建聯(lián)合生物標(biāo)志物，通過自身驗(yàn)證和交互驗(yàn)證評(píng)估聯(lián)合標(biāo)志物在IgA腎病患者中腎臟纖維化的診斷價(jià)值。
　　結(jié)果:
　　1.本研究構(gòu)建的腎臟纖維化靶向PCR芯片可準(zhǔn)確定量檢測(cè)86種目的m

7、RNA。該芯片基因擴(kuò)增曲線圖譜呈S型，熔解曲線分析呈單峰;所有樣本基因檢測(cè)陽(yáng)性率均大于85％; PPC孔均值20.63±0.35，變異度僅為1.69％。
　　2.通過芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)篩查組和驗(yàn)證組中CKD患者尿液VIM mRNA水平較健康對(duì)照組顯著升高。Spearman相關(guān)性分析提示，VIM mRNA水平與血肌酐、尿素氮、腎小球?yàn)V過率、腎小球硬化評(píng)分和小管間質(zhì)纖維化評(píng)分之間存在顯著相關(guān)。Multiple logistic regres

8、sion進(jìn)一步提示，尿液VIM mRNA表達(dá)水平是腎臟纖維化的重要危險(xiǎn)因素并可有效區(qū)分不同嚴(yán)重程度的纖維化。
　　3.IgA腎病腎臟纖維化相關(guān)PCR芯片90個(gè)候選基因中，有50個(gè)尿液mRNA在IgA腎病和健康對(duì)照中存在顯著表達(dá)差異，其中BCL2、CASP3、PAI1、TIMP2、VIM，P53、SYNPO、MCP-1、TGF-β1的mRNA水平與血清肌酐、eGFR和腎臟纖維化評(píng)分顯著相關(guān)。利用BCL2、PAI1、TGF-β1三個(gè)基

9、因構(gòu)建的聯(lián)合標(biāo)志物可有效診斷IgA腎病患者腎臟纖維化水平，其中敏感性、特異性、約登指數(shù)分別為91.3％，85.7％，0.77，ROC分析提示曲線下面積為0.92(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.本研究首次構(gòu)建了一種腎臟纖維化靶向的熒光定量PCR芯片。所構(gòu)建的纖維化靶向PCR芯片具有良好的靈敏度、特異度和可重復(fù)性，為腎臟纖維化無(wú)創(chuàng)性診斷提供了新的技術(shù)平臺(tái)。
　　2.尿液VIM mRNA水平可有效區(qū)分不同嚴(yán)重程度的纖