1、MicroRNA(miRNA)是一類非編碼小RNA，在生物體中起著至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。MiRNA通常是通過(guò)RISC復(fù)合物與靶基因mRNA的3’未翻譯區(qū)的靶位點(diǎn)序列互補(bǔ)結(jié)合，導(dǎo)致靶基因mRNA降解或者抑制其翻譯成相關(guān)蛋白。一類miRNA往往能夠同時(shí)調(diào)控多個(gè)具有相同靶位點(diǎn)的靶基因，與此同時(shí)，一個(gè)靶基因可能被多種miRNA進(jìn)行調(diào)控。果蠅中的剪切增強(qiáng)子E(spl)m4基因是miRNA的靶基因，該基因存在于Notch信號(hào)途徑末端，miRNA

2、通過(guò)調(diào)控E(spl)m4參與Notch信號(hào)途徑調(diào)控，調(diào)節(jié)果蠅的神經(jīng)發(fā)育。前期研究從家蠶中克隆得到了果蠅E(spl)m4的同源基因，并將其命名為BmEm4[Bombyx mori E(spl)m4]，并獲得了效價(jià)較高的BmEm4多克隆抗體。通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該基因的3’端未翻譯區(qū)存在多個(gè)潛在的miRNA結(jié)合位點(diǎn)序列區(qū)(3個(gè)Brd box，1個(gè)GY box，2個(gè)K box等)。本課題研究了家蠶bmo-miR-79對(duì)BmEm4的調(diào)控作用

3、，為研究家蠶miRNA對(duì)Notch信號(hào)通路的影響打下基礎(chǔ)。
　　基于前期研究成果，本研究進(jìn)一步開(kāi)展bmo-miR-79靶基因的雙熒光素酶驗(yàn)證。首先通過(guò)PCR方法將BmEm4基因正常的3’UTR及靶位點(diǎn)序列Brd box、K box突變后的3’UTR克隆至pIEx-1-Rluc-Luc載體上(實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的雙熒光素酶載體)。將該重組載體與體外合成的bmo-miR-79 mimics及Negative control共轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞

4、，雙熒光素酶報(bào)告基因法檢測(cè)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照相比，重組載體與bmo-miR-79 mimics共轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞后報(bào)告基因螢火蟲(chóng)熒光素酶催化底物的發(fā)光值降低，與此同時(shí)，由靶位點(diǎn)序列突變后的3’UTR構(gòu)建的重組載體與陰性對(duì)照及bmo-miR-79mimics共轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞的結(jié)果并無(wú)明顯差別。結(jié)果表明，BmEm4基因是bmo-miR-79的靶基因，且靶位點(diǎn)位于該基因的3’UTR的Brd box及K box區(qū)域。
　　為了進(jìn)一步驗(yàn)證

5、bmo-miR-79對(duì)靶基因BmEm4的調(diào)控作用，我們用不同濃度的bmo-miR-79mimics轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞使其在細(xì)胞中上調(diào)，并用Western Blotting的方法檢測(cè)了轉(zhuǎn)染后不同時(shí)段的BmEm4的表達(dá)譜。轉(zhuǎn)染不同濃度bmo-miR-79后BmEm4基因的翻譯表達(dá)水平均有下調(diào)，高濃度bmo-miR-79轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中BmEm4蛋白下調(diào)顯著，且在72h后抑制效果達(dá)到近50％。為了驗(yàn)證bmo-miR-79在家蠶發(fā)育時(shí)期對(duì)BmEm4

6、基因的表達(dá)調(diào)控作用，我們開(kāi)展了bmo-miR-79和BmEm4基因在家蠶發(fā)育時(shí)期的表達(dá)譜研究。結(jié)果表明，家蠶各個(gè)發(fā)育時(shí)期BmEm4及bmo-miR-79的表達(dá)水平差異明顯各異，BmEm4蛋白的翻譯水平相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平來(lái)說(shuō)受到不同程度的抑制，抑制程度由高到低依次為蛹、卵和蛾，研究結(jié)果進(jìn)一步證明家蠶bmo-miR-79在家蠶發(fā)育時(shí)期對(duì)BmEm4表達(dá)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控，可能進(jìn)一步調(diào)控家蠶Notch信號(hào)通路。
　　前期研究發(fā)現(xiàn)BmEm4基

7、因在BmAGO2結(jié)合RNA中富集較多，是潛在的miRNA靶基因。凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)bmo-miR-79能與具有生物活性的BmAGO2蛋白互作，表明bmo-miR-79可通過(guò)和BmAGO2蛋白結(jié)合形成的miRISC復(fù)合物對(duì)BmEm4進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控，與以往miRNA行使基因調(diào)控功能的過(guò)程依賴于AGO蛋白等組成的RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體的研究結(jié)論相符。
　　BmEm4基因是家蠶Notch信號(hào)通路家族成員之一，關(guān)于家蠶Notch信號(hào)