1、目前，在體外可構建出原始毛發(fā)樣結構。但僅僅實現由“細胞—組織”的轉變。體外構建的毛囊結構形態(tài)較幼稚，需進一步移植至體內才能發(fā)育成完整毛囊。因此我們不難看出，目前的體外毛囊重建模型仍然太過簡單，不足以為毛囊再生提供適宜的微環(huán)境（細胞、細胞因子、信號分子和營養(yǎng)物質等），導致體外誘導的毛囊單位形態(tài)不成熟。已有大量研究證實脂肪細胞、毛囊間表皮干細胞、骨髓細胞等細胞成分，TGF、VEGF等生長因子及Wnt、BMP等信號分子對毛囊再生有重要作用。但

2、是哪種成分起關鍵作用仍不得而知。因此我們以經酶分離得到的新生鼠的細胞通過毛囊體內重建模型先探究不同宿主對毛囊重建的影響，再研究宿主細胞是否參與了毛囊重建的過程，最后通過Cell-in-a-box試劑盒隔絕宿主細胞，探究在沒有宿主細胞參與的情況下毛囊重建的情況。以期通過上述研究對體外毛囊重建受限做出解釋，探究毛囊重建微環(huán)境，為將來的體外毛囊重建提供指導。
　　一、不同宿主對毛囊重建的影響
　　目的:明確不同宿主對毛囊重建的影響

3、
　　方法:取出生1天內的GFP乳鼠，PBS(含1％青鏈霉素)清洗1次，剝離皮膚，PBS（含1％青鏈霉素）清洗3次。0.1％中性蛋白酶4℃消化過夜，將表皮和真皮分離并分別剪碎，真皮用0.2％膠原酶37℃消化1小時，每15分鐘吹打振蕩1次。表皮用0.25％胰酶37℃消化10分鐘。制備成新鮮分離的真皮和表皮細胞，加入DMEM高糖培養(yǎng)基重懸，細胞計數。取部分真皮、表皮細胞以2∶1比例混合，表皮細胞分別為0.1×106個、0.5×106個

4、、1.0×106個、2.5×106個。同時，將剩余表皮細胞與真皮細胞以不同的比例混合，分別為表皮細胞0.1×106個+真皮細胞1×106個、表皮細胞0.5×106個+真皮細胞1.0×106個、表皮細胞2.5×106個+真皮細胞1.0×106個，表皮細胞0.5×106個，真皮細胞1×106個，各組細胞組合均以100ul高糖DMEM重懸，且100ul為1個單位，備好細胞懸液待注射。無菌條件下注射于裸鼠及脫去背部毛發(fā)的C57BL/6鼠背部中線

5、兩側。每只鼠注射6個點。每天觀察注射部位皮膚的顏色變化。于術后2、4、7、14、18、21天移植部位取材，隨后每隔3天取材，直至觀察到新生毛囊重新進入生長期，體視鏡下觀察，做石蠟、冰凍切片，正置顯微鏡下觀察。取移植后21天形成的毛發(fā)做掃描電鏡檢查。將各細胞量組合的注射點在14天取材，對形成的毛發(fā)進行計數
　　結果:裸鼠和C57BL/6鼠體內均可形成新的毛囊，新生毛囊在誘導階段大致相同，4天有黑色毛球形成，7天形成毛干。但C57BL

6、/6鼠新生毛囊在18天進入退行期，而裸鼠在21天。C57BL/6鼠新生毛囊在33天重新進入生長期，裸鼠則在39天。石蠟切片見再生毛囊結構完整，冷凍切片熒光檢測見明亮綠色熒光。細胞以不同的比例移植后發(fā)現，C57BL/6鼠體內毛囊重建效率高于裸鼠，且二者的真表皮細胞的最佳比例不同，單一細胞移植至兩種鼠體內時均無毛發(fā)形成。裸鼠體內形成毛發(fā)直徑與正常毛發(fā)相近，但明顯較C57BL/6鼠體內形成毛發(fā)直徑粗。
　　結論:以兩種不同種系的老鼠作為

7、宿主，通過注射法重建毛囊，兩種老鼠體內毛囊重建效率不同，且重建毛囊的生長周期和毛干的直徑也有明顯差異，宿主因素對毛囊的形態(tài)發(fā)生有重要影響。
　　二、毛囊重建過程中宿主細胞的參與情況
　　目的:明確非皮下注射時宿主細胞是否參與毛囊重建過程
　　方法:取出生1d內RFP乳鼠皮膚，PBS(含1％青鏈霉素)清洗，0.1％中性蛋白酶4℃消化過夜，然后用顯微鑷將表皮和真皮分離并分別剪碎，真皮用0.2％膠原酶37℃消化1h，表皮用0

8、.25％胰酶消化10min。消化結束后各加入等體積DMEM高糖培養(yǎng)基（含10％胎牛血清）終止消化，制備成新鮮分離的真皮和表皮細胞懸液，細胞計數。將真皮細胞和表皮細胞以2∶1的比例混合，調整細胞濃度為1.5×107/ml，100 ul為1個單位，備好細胞懸液待注射。GFP鼠麻醉后去除背部毛發(fā)，常規(guī)消毒，將制備好的細胞懸液每次1單位，無菌條件下注射至肉膜下，每只鼠注射6個點作為對照。每天觀察注射部位皮膚的顏色變化，14d后取材，常規(guī)石蠟切片

9、、HE染色、冰凍切片及DAPI染色，鏡下觀察。
　　結果:注射后第4d可見注射部位皮膚變灰，并有輕微隆起。第8d，皮膚顏色加深，呈黑色。隨后由于RFP鼠自身毛發(fā)生長，不易觀察。第14d取材發(fā)現，單獨注射表皮或者真皮細胞組未見毛發(fā)形成，表皮和真皮細胞混合注射可見大量毛囊形成，毛囊結構完整。石蠟切片見肉膜完整，新生毛囊位于肉膜下層。冰凍切片及DAPI染色可見新形成的毛囊中大部分為紅色熒光細胞，少部分為綠色熒光細胞。
　　結論:利

10、用兩種表達不同熒光蛋白的老鼠以注射法重建毛囊，通過觀察熒光細胞分布，發(fā)現重建的毛囊中有宿主細胞，即宿主細胞參與了毛囊重建過程。該方法簡化了操作過程，有較強特異性。但宿主細胞的具體來源仍不清楚，有待進一步的研究。
　　三、宿主細胞在毛囊重建中的作用
　　目的:驗證無宿主細胞參與下毛囊體內構建是否能夠完成
　　方法:1.1 將出生1d內的GFP、RFP轉基因乳鼠處死后，于濃度為75％的乙醇中浸泡20 S后，PBS(含1％青

11、鏈霉素)清洗3次，剪去鼠尾巴和四肢后剝離皮膚，PBS(含1％青鏈霉素)清洗3次。0.1％中性蛋白酶4℃消化過夜，將表皮和真皮分離，并分別剪碎，真皮用0.2％膠原酶37℃消化1h，每15min吹打振蕩1次。表皮用0.25％胰酶37℃消化10min。分別制備成分離的真皮和表皮細胞懸液，細胞計數。
　　1.2 囊球的包裹取RFP表皮細胞0.7×106，GFP真皮細胞1.4×106，按產品說明包裹細胞，包裹完成后用無菌的PBS反復清洗制備

12、的囊球，備用。
　　1.3 囊球的體內移植及體外培養(yǎng)將裸鼠常規(guī)麻醉消毒，將含表皮和真皮細胞的囊球移植于裸鼠皮下，移植空白囊球作為對照，每只裸鼠移植一個點，每點移植10個囊球，每組各6只裸鼠。剩余囊球置于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基為(DMEM+10％FBS∶ Cnt07=2∶1)，將培養(yǎng)皿置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期鏡下觀察囊球中細胞生長情況。
　　1.4 20天后將部分體外培養(yǎng)的囊球中的細胞球取出重新接種，觀察細胞遷出情況

13、;部分細胞球做常規(guī)石蠟切片，HE染色。剩余囊球繼續(xù)體外培養(yǎng)。10天后將體內移植的部分囊球取材，鏡下觀察，將細胞球取出部分用于做常規(guī)石蠟切片，HE染色。剩余部分囊球繼續(xù)體內培養(yǎng)，40天后取材觀察。
　　1.5 將體內移植10天后的囊球中的細胞球重新取出移植到裸鼠體內，觀察毛發(fā)形成情況。
　　1.6 用RFP乳鼠真皮和表皮細胞重復上述步驟，將體內移植10天后的囊球中的細胞球重新取出移植到GFP鼠體內，觀察毛發(fā)形成情況。
　

14、　結果:包裹的細胞體外培養(yǎng)時逐漸發(fā)生聚集，形成細胞球，于包裹后第10天細胞球形態(tài)趨于穩(wěn)定，石蠟切片未見明顯分化現象。將形成的細胞球重新接種于培養(yǎng)基中，細胞球中的細胞可重新貼壁遷出。移植至裸鼠體內的囊球于移植后10天取材，發(fā)現囊球保存完好，未發(fā)生破裂，顯微鏡下見囊球中的細胞發(fā)生聚集，形成細胞球，無明顯毛干，石蠟切片可見形成同心圓樣結構。40天時仍未見明顯毛囊樣結構形成。將體內移植的囊球中的細胞球取出后移植到體內可見毛發(fā)形成。移植至轉基因鼠