1、目的：腎小管間質纖維化(tubulointerstitialfibrosis，TIF)是各種慢性腎臟病(chronickidneydisease，CKD)進展的共同途徑和主要病理特征[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)上皮細胞間充質轉化(epithdial-mesenchymaltransition，EMT)是腎間質纖維化中的關鍵事件。EMT受多種生長因子和細胞因子的調節(jié)，其中最重要的是轉化生長因子β1(Transforminggrowthfactor

2、-β1，TGF-β1)。TGF-β1具有廣泛的生物學效應，大量試驗證據(jù)表明TGF-β1在多數(shù)腎臟疾病中參與進展性腎纖維化的病理形成[2]。尋找能夠抑制TGF-β1致纖維化作用的藥物將具有十分重要的臨床意義。冬蟲夏草作為祖國傳統(tǒng)中藥，應用于慢性腎臟病的治療已有逾千年的歷史[3]，然而，其確切機制仍不十分清楚。通過與英國Cardiff大學合作，從人工培養(yǎng)的冬蟲夏草菌絲體中成功提取出蟲草多糖(Cordycepspolysaccharide，C

3、p)F1組分，其中葡萄糖:甘露糖:半乳糖=1:0.6:0.75，不含酸性的單糖成分，平均分子量為210KDa。本研究擬對Cp的生物學作用進行探討，著重觀察Cp對TGF-β1誘導人近端腎小管上皮細胞間充質轉化的影響。 方法：人近端腎小管上皮細胞株(humanproximaltubularcellline，HPTCL)HK-2細胞用含10％胎牛血清(fetalcalfserum，F(xiàn)CS)的低糖型Dulbecco'sModifiedE

4、agle'sMedium(DMEM)培養(yǎng)液培養(yǎng)，待細胞生長至80％-85％融合時，改用無血清DMEM培養(yǎng)液靜置24h，將細胞同步靜止于G0期。用四甲基偶氮唑鹽(MTF)比色法檢測Cp對HK-2細胞的增殖作用。應用體外細胞培養(yǎng)技術建立人近端腎小管上皮細胞HK-2細胞株創(chuàng)傷愈合模型，觀察Cp對TGF-β1抑制HK-2細胞損傷修復的影響。通過觀察并計算進入損傷中央裸露區(qū)的細胞數(shù)來觀察細胞的修復活力；利用細胞免疫化學方法進行BrDu染色，檢測細

5、胞增殖作用在Cp促進損傷修復中的意義。用不同濃度的TGF-β1(0、0.1、0.5、1、5、10μg/L)作用HK-2細胞48h及濃度為5μg/L的TGF-β1作用不同時間，以Real-timePCR和Western免疫印跡方法檢測僅α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)，鈣粘蛋白(E-cadherin)，纖連蛋白(FN)的表達。用逐漸遞增濃度的Cp(1、5、10g/L)預處理HK-2細胞24h后，觀察其對TGF-β1的干預作用。分別采用We

6、stern免疫印跡技術，Real-timePCR技術檢測TGF-β1I型受體(TGFβ1RI)蛋白及mRNA的表達。將含有人類SMAD-反應性基因啟動子的熒光素酶報告基因轉染HK-2細胞，檢測Cp干預后腎小管上皮細胞對TGF-β1反應性變化。 結果：不同濃度的Cp(0.01、0.1、1、5、10g/L)以劑量依賴方式促進HK-2細胞增殖(P<0.05)。在創(chuàng)傷愈合模型中，TGF-β1(5μg/L)明顯抑制損傷區(qū)HK-2細胞的修復

7、，該效應能被Cp(10g/L)有效拮抗。同對照組相比，TGF-β1干預48h，創(chuàng)傷區(qū)BrDu染色無明顯變化，而Cp組BrDu染色陽性細胞數(shù)明顯增多(陽性率52.9％)。TGF-β1無論在轉錄水平還是蛋白水平皆能誘導HK-2細胞α-SMA，F(xiàn)N表達上調，而使E-cadherin表達下調(P<0.05)，呈時間及濃度依賴性。分別加用逐漸遞增濃度Cp(1、5、10g/L)預干預24h后，同單獨TGF-β1(5μg/L)刺激組相比，上述因子表達

8、被不同程度逆轉。在轉錄水平，α-SMAmRNA表達抑制率分別為37.98％、68.08％、84.36％：FNmRNA表達抑制率分別為46.97％、63.82％、81.85％；E-cadherinmRNA表達分別增加0.67倍、2.69倍、5.43倍(P均<0.05)。在蛋白水平，α-SMA蛋白表達抑制率分別為33.40％、47.75％、68.50％；FN蛋白表達抑制率分別為16.26％、65.92％、80.30％；E-cadherin蛋

9、白表達分別增加1.33倍、3.19倍、4.29倍(P均<0.05)。Cp能明顯拮抗TGF-β1誘導的HK-2細胞的表型改變。逐漸遞增濃度Cp(1、5、10g/L)可以顯著抑制TGF-β1RI蛋白水平的表達(分別下降為對照組的88.6％、57.9％、3.0％)，mRNA結果也有類似改變。同單獨TGF-β1(5μg/L)刺激組相比，Cp(1、5、10g/L)干預組腎小管上皮細胞對TGF-β1的反應性分別下降15.96％、38.35％、59.