1、第一部分:吸煙對重型顱腦損傷伴發(fā)急性肺損傷的影響
　　 目的:
　　 探討吸煙對重型顱腦損傷伴發(fā)急性肺損傷的影響。
　　 方法:
　　 選擇162例我院于2010年1月至2011年12月收治的重型顱腦損傷患者，其中男性139例，女性23例，年齡18～72歲，平均年齡(44.86±13.51)歲。其中交通事故傷85例，高空墜落傷30例，跌倒傷28例，暴力傷8例，其他11例。根據(jù)是否吸煙分為吸煙組（74例）和

2、非吸煙組（88例）。
　　 于入院后第5天依據(jù)急性肺損傷診斷標(biāo)準(zhǔn)判斷重型顱腦損傷患者是否患有急性肺損傷，比較吸煙組與非吸煙組急性肺損傷發(fā)病率。于入院后第0、5天檢測重型顱腦損傷患者肺功能。肺容量指標(biāo):呼吸頻率(Breathingfrequency,BF)、肺活量(Vitalcapacity,VC);肺通氣量指標(biāo):用力呼氣一秒量(Forcedexpiratoryvolumeinthefirstsecond，F(xiàn)EV1)、用力呼氣肺活

3、量(Forcedexpiratoryvitalcapacity，F(xiàn)VC)、最大分鐘通氣量(Mostminuteventilation，MMV);小氣道指標(biāo):最高呼氣流速(Peakexpiratoryflow,PEF)。于入院后第0、5天采集肺泡灌洗液，按照試劑盒說明書檢測肺泡灌洗液上清液中的腫瘤壞死因子-α(Tumornecrosisfactor-alpha，TNF-α)，白介素-8(interleukin-8，IL-8)和丙二醛(Ma

4、londialdehydeMDA)水平及超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，SOD)活性。
　　 結(jié)果:
　　 1.吸煙組中有26例重型顱腦損傷患者伴發(fā)急性肺損傷，發(fā)病率達(dá)到35.14％，而非吸煙組中僅有16例伴發(fā)急性肺損傷，發(fā)病率為18.18％，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.019)。
　　 2.入院后第0天，吸煙組的BF、VC、FEV1、FVC、MMV、PEF均低于非吸煙組，其中，兩組的

5、MMV、PEF的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。入院后第5天與入院后第0天比較，兩組患者的肺功能均呈下降趨勢，吸煙組的下降趨勢較非吸煙組更為明顯。
　　 3.入院后第0天，吸煙組的TNF-α、IL-8、MDA水平均高于非吸煙組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);吸煙組的SOD活性低于非吸煙組。入院后第5天與入院后第0天比較，兩組患者的TNF-α、IL-8、MDA水平均呈上升趨勢，吸煙組的上升趨勢較非吸煙組更為明顯;兩組患者

6、的SOD活性呈下降趨勢，吸煙組的下降趨勢較非吸煙組更為明顯。入院后第5天，兩組的4個(gè)指標(biāo)具有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 與非吸煙組相比較，吸煙組的重型顱腦損傷患者的基礎(chǔ)肺功能和SOD活性較低，TNF-α、IL-8和MDA水平較高;傷后肺功能和SOD活性降低以及TNF-α、IL-8和MDA水平升高更為明顯，急性肺損傷發(fā)病率更高，可能與吸煙和顱腦損傷協(xié)同促進(jìn)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激相關(guān)。
　　 第二部

7、分:穿心蓮內(nèi)酯在被動(dòng)吸煙誘發(fā)肺損傷中的保護(hù)作用
　　 目的:
　　 本部分研究穿心蓮內(nèi)酯對吸煙誘導(dǎo)的小鼠肺部急性炎癥反應(yīng)的作用。
　　 方法:
　　 本研究所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為32只清潔級成年雄性C57BL/6小鼠（6-8周齡），體重為18-20g。將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為4組（每組8只），分別為:正常對照組(C)、煙草煙霧暴露組(CS)、用溶質(zhì)DMSO處理的煙草煙霧暴露組(CS+DMSO)和穿心蓮內(nèi)酯處理的煙草煙霧

8、暴露組(CS+A)。穿心蓮內(nèi)酯是在煙草煙霧暴露前1h通過腹腔內(nèi)注射途徑給予，劑量為1mg/kg體重。將模型組小鼠置于被動(dòng)吸煙箱中，每天被動(dòng)吸煙9支，連續(xù)4天。對照組小鼠置于相同的實(shí)驗(yàn)條件下只是不接受被動(dòng)吸煙處理。小鼠于實(shí)驗(yàn)第5天經(jīng)腹腔注射過量戊巴比妥鈉處死。收集支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolarlavagefluid，BALF)，并作肺部組織學(xué)分析。對BALF中細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并經(jīng)Wright-Giemsa染色進(jìn)行細(xì)胞分類記

9、數(shù)。ELSIA法分析BALF中腫瘤壞死因子-α(Tumornecrosisfactor-alpha，TNF-α)，白介素-6(Interleukin-6，IL-6)，巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-2(Macrophageinflammatoryprotein-2，MIP-2)，白介素10(interleukin-10，IL-10)，LPS誘導(dǎo)CXC趨化因子(LPS-inducedCXCchemokine，LIX)，干擾素γ(interferon-γ

10、，IFN-γ)的水平。并對肺組織髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性進(jìn)行測定。體外研究中，肺上皮細(xì)胞A549細(xì)胞作為細(xì)胞模型。用DNA片段化法分析穿心蓮內(nèi)酯對煙草煙霧誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡的影響，并用Westernblot法分析穿心蓮內(nèi)酯對煙草煙霧介導(dǎo)的凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果:
　　 HE染色顯示，被動(dòng)吸煙組小鼠肺部毛細(xì)血管充血，肺泡出血;肺泡壁稍增厚;肺泡腔內(nèi)充滿大量單核/巨噬細(xì)胞

11、，多形核白細(xì)胞等炎癥細(xì)胞，以及大量滲出液。DMSO處理對吸煙誘導(dǎo)的肺部急性炎癥反應(yīng)沒有明顯影響。而穿心蓮內(nèi)酯處理組小鼠肺泡炎癥輕，肺泡腔中炎癥細(xì)胞及滲出液較少。穿心蓮內(nèi)酯能夠抑制吸煙誘導(dǎo)的肺部炎癥反應(yīng)還表現(xiàn)為:穿心蓮內(nèi)酯能夠顯著抑制吸煙誘導(dǎo)的小鼠BALF中總細(xì)胞，單核/巨噬細(xì)胞，中性粒細(xì)胞以及淋巴細(xì)胞的數(shù)目的增加，減少吸煙介導(dǎo)的小鼠BALF中腫瘤壞死因子-α，白介素-6和巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-2的分泌，以及降低吸煙誘發(fā)的肺部髓過氧化物酶的活

12、性。體外結(jié)果顯示，煙草煙霧處理能夠促進(jìn)A549細(xì)胞的凋亡，而穿心蓮內(nèi)酯能夠顯著抑制煙草煙霧誘導(dǎo)的A549細(xì)胞的凋亡。
　　 結(jié)論:
　　 穿心蓮內(nèi)酯能夠抑制吸煙誘導(dǎo)的小鼠肺部的急性損傷;能夠保護(hù)煙霧煙草介導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞A549細(xì)胞的凋亡。
　　 第三部分:穿心蓮內(nèi)酯在被動(dòng)吸煙誘發(fā)肺損傷中作用機(jī)制
　　 目的:
　　 深入揭示穿心蓮內(nèi)酯影響吸煙誘導(dǎo)肺損傷的相關(guān)分子機(jī)制，重點(diǎn)探討血紅素加氧酶-1(He

13、meoxygenase-1，HO-1)通路對該藥物發(fā)揮保護(hù)作用的貢獻(xiàn)。
　　 方法:
　　 在體外研究中肺上皮細(xì)胞A549細(xì)胞作為細(xì)胞模型。利用RT-PCR和Westernblot法研究煙草煙霧和穿心蓮內(nèi)酯對A549細(xì)胞中HO-1mRNA和蛋白表達(dá)的影響。本研究所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為32只清潔級成年雄性C57BL/6小鼠（6-8周齡），體重為18-20g。將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為4組（每組8只），分別為:正常對照組(C)、煙霧暴露組(

14、CS)、穿心蓮內(nèi)酯處理組(A)和穿心蓮內(nèi)酯+ZnPP組(A+Z)。穿心蓮內(nèi)酯是在煙霧暴露前1h通過腹腔內(nèi)注射途徑給予，劑量為1mg/kg體重。ZnPP為一種很強(qiáng)的HO抑制劑，本文應(yīng)用其阻斷HO-1通路。ZnPP在穿心蓮內(nèi)酯注射之前1h通過腹腔注射方式給予，劑量為10μmol/kg體重。對照組小鼠通過腹腔注射給予等量的生理鹽水。將模型組小鼠置于被動(dòng)吸煙箱中，每天被動(dòng)吸煙9支，連續(xù)4天。對照組小鼠置于相同的實(shí)驗(yàn)條件下只是不接受被動(dòng)吸煙處理。

15、小鼠于實(shí)驗(yàn)第5天經(jīng)腹腔注射過量戊巴比妥鈉處死。收集支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolarlavagefluid，BALF)，并作肺部組織學(xué)分析。PCR和Westernblot用來檢測小鼠肺組織中HO-1RNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，并對肺組織HO-1酶活性進(jìn)行測定。對BALF中細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并經(jīng)Wright-Giemsa染色進(jìn)行細(xì)胞分類記數(shù)。用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定BALF總蛋白濃度。ELSIA法分析BALF中瘤壞死因子-α

16、(Tumornecrosisfactor-alpha，TNF-α)，白介素-6(Interleukin-6，IL-6)和巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-2(Macrophageinflammatoryprotein-2，MIP-2)的水平。對肺組織和BALF中的MDA水平進(jìn)行測定。并對BALF中LDH的活性以及肺組織中超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，SOD)，谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathioneperoxidase，GS

17、H-Px)，過氧化氫酶(Catalase，CAT)和髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性進(jìn)行測定。Westernblot法檢測穿心蓮內(nèi)酯對信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化子3(signaltransducerandactivatoroftranscription3，STAT3)通路活化的影響。
　　 結(jié)果:
　　 煙草煙霧處理和穿心蓮內(nèi)酯預(yù)處理顯著增加HO-1mRNA和蛋白表達(dá)。而且這種誘導(dǎo)作用呈劑量依賴關(guān)系，這

18、提示HO-1在煙草煙霧誘導(dǎo)細(xì)胞損傷過程中可能具有保護(hù)作用。HE染色顯示，被動(dòng)吸煙組小鼠肺部毛細(xì)血管充血，肺泡出血;肺泡壁稍增厚;肺泡腔內(nèi)充滿大量單核/巨噬細(xì)胞，多形核白細(xì)胞等炎癥細(xì)胞，以及大量滲出液。DMSO處理對吸煙誘導(dǎo)的肺部急性炎癥反應(yīng)沒有明顯影響。而穿心蓮內(nèi)酯處理組小鼠肺泡炎癥輕，肺泡腔中炎癥細(xì)胞及滲出液較少，表明穿心蓮內(nèi)酯能夠抑制吸煙誘導(dǎo)的肺部炎癥反應(yīng)。而用ZnPP阻斷HO-1通路后，穿心蓮內(nèi)酯的保護(hù)作用被逆轉(zhuǎn)。這說明穿心蓮內(nèi)酯

19、對吸煙誘導(dǎo)肺部炎癥的抑制作用依賴于HO-1通路活化。另外，穿心蓮內(nèi)酯能夠抑制吸煙誘導(dǎo)的肺部炎癥反應(yīng)還表現(xiàn)為:穿心蓮內(nèi)酯能夠顯著抑制吸煙誘導(dǎo)的小鼠BALF中總細(xì)胞，單核/巨噬細(xì)胞，中性粒細(xì)胞以及淋巴細(xì)胞的數(shù)目的增加，減少吸煙介導(dǎo)的的小鼠BALF總蛋白濃度，腫瘤壞死因子-α，白介素-6和巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-2的分泌，減少吸煙誘導(dǎo)的肺組織和BALF中的MDA水平。以及降低吸煙誘發(fā)肺組織中超氧化物歧化酶，谷胱甘肽過氧化物酶，過氧化氫酶和髓過氧化物

20、酶的活性和BALF中LDH的活性。而穿心蓮內(nèi)酯介導(dǎo)的這些保護(hù)吸煙誘導(dǎo)肺部炎癥反應(yīng)的作用均隨著ZnPP抑制HO-1信號通路而被逆轉(zhuǎn)，提示HO-1在穿心蓮內(nèi)酯對被動(dòng)吸煙誘導(dǎo)的肺氧化應(yīng)激、炎癥及損傷的保護(hù)效應(yīng)中起著重要的作用。穿心蓮內(nèi)酯處理顯著提高吸煙小鼠肺組織中STAT3磷酸化水平，而對總STAT3蛋白影響不明顯，這表明穿心蓮內(nèi)酯可促進(jìn)肺組織STAT3通路活化。穿心蓮內(nèi)酯對STAT3通路的活化作用能夠被ZnPP抑制，這提示STAT3可能位于