1、實驗目的：
　　中暑是一種嚴重威脅人民健康和生命的疾病，主要表現(xiàn)為高體溫（超40℃），而重癥中暑表現(xiàn)為以中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙（伴有驚厥、譫妄、昏迷）為突出表現(xiàn)的多臟器功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）。盡管臨床上采取積極的降溫并實施積極的臟器支持，但重癥中暑的生存率仍沒有很大的改善。本研究以人血單核細胞作為研究對象，通過熱應激聯(lián)合脂多糖刺激體外模擬重癥中暑，觀察人血單

2、核細胞活性功能和表面分子變化，探索分析重癥中暑炎癥反應的發(fā)生機制為重癥中暑的臨床救治提供可能的指導方向。
　　實驗方法：
　　①實驗對象為人外周血經(jīng)過ficoll密度梯度離心法分離并貼壁培養(yǎng)后獲得的人血單核細胞。
　?、诮釕ぢ?lián)合脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）雙重打擊人血單核細胞模型：人血單核細胞于43℃細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)30分鐘后，再用500ng/mLLPS刺激培養(yǎng)12小時。
　?、蹮釕?/p>

3、激聯(lián)合LPS雙重打擊人血單核細胞功能活性檢測：ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清中炎癥介質(zhì)含量白細胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)、白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）。
　?、蹹CFHDA探針熒光染色后流式細胞儀檢測細胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species,ROS）水平；使用吞噬熒光微球法，熒

4、光顯微鏡下觀察吞噬熒光微球的人血單核細胞，流式細胞儀檢測吞噬熒光微球數(shù)目。
　　⑤熱應激聯(lián)合LPS雙重打擊人血單核細胞表面分子表達檢測：流式細胞儀檢測細胞表面分子，包括CD86、髓系細胞觸發(fā)受體-1(triggering receptor expressed on myeloid cells-1,TREM-1)和 Toll樣受體4(Tolllikereceptors4,TLR4)；實時定量聚合酶鏈反應(Real-time Poly

5、merase Chain Reaction，RT-PCR)檢測TREM-1和TLR4的mRNA水平；蛋白質(zhì)免疫印跡(western blot，WB)檢測TREM-1和TLR4蛋白水平的表達。
　　實驗結(jié)果：
　?、贌釕ぢ?lián)合LPS刺激升高人血單核細胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1β及IL-10濃度，增強人血單核細胞炎癥分泌活性。
　?、跓釕ぢ?lián)合LPS刺激增加人血單核細胞內(nèi)活性氧簇（ROS）表達，增強人血單核細胞氧化分

6、泌活性。
　?、蹮釕ご驌粢种迫搜獑魏思毎淌晒δ埽^單純熱應激打擊，熱應激聯(lián)合LPS對人血單核細胞吞噬功能抑制作用更為明顯。
　　④熱應激聯(lián)合LPS刺激降低人血單核細胞表面分子CD86表達率，增加人血單核細胞表面分子TREM-1和TLR4表達率。
　　⑤熱應激聯(lián)合LPS刺激增加人血單核細胞表面分子TREM-1和TLR4蛋白和mRNA表達水平。
　　結(jié)論：
　　熱應激聯(lián)合LPS刺激增強人血單核細胞炎癥氧化分