1、分類號：$5121密級：公玨單位代碼：學號：100862009305小麥幼胚農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化OptimizationotAg礦obacteri優(yōu)”1MediatedTransformationusingWheatimmatureembryos學位申請人：指導教師：學科專業(yè)：學位類別：授予單位：答辯B期：武海娜溫樹敏研究員劉桂茹教授植物資源學農(nóng)學碩士河北農(nóng)業(yè)大學二。一二年五月二十五日摘要小麥幼胚培養(yǎng)能力高、植株再生能力強，被認為是轉(zhuǎn)基因

2、最理想的外植體材料，利用農(nóng)桿菌介導法進行小麥幼胚遺傳轉(zhuǎn)化研究有助于推動小麥基因工程育種的進程。本研究以不同小麥基因型的幼胚為受體材料，通過篩選高培養(yǎng)力基因型，改良誘導培養(yǎng)基和愈傷分化再生等途徑，優(yōu)化了小麥幼胚組織培養(yǎng)高頻再生體系。在此基礎上采用農(nóng)桿菌介導的方法對小麥幼胚愈傷組織進行EeAP2，J、OsDREB22等抗逆轉(zhuǎn)錄因子的遺傳轉(zhuǎn)化，并對影響遺傳轉(zhuǎn)化效率的因素進行了研究，優(yōu)化了農(nóng)桿菌介導的小麥幼胚遺傳轉(zhuǎn)化體系。獲得的主要研究結果如下

3、：1通過對不同基因型小麥材料進行幼胚愈傷組織誘導及分化再生試驗，明確了小麥的胚齡、基因型、幼胚愈傷誘導培養(yǎng)基、生長素和細胞分裂素是影響小麥幼胚愈傷組織形成和分化再生的重要因素，確定了在保定地區(qū)河農(nóng)827等4個冬小麥品種幼胚的最佳培養(yǎng)時期為胚齡12～16d；NO17、DIC、Wl、W2四種改良培養(yǎng)基誘導愈傷效果較好；最佳分化培養(yǎng)基激素配比：10mg／LKT02—04mg／LNAA；篩選出4個適合小麥幼胚培養(yǎng)和植株再生的基因型材料，初步優(yōu)化

4、了小麥幼胚愈傷組織再生體系。2對14個小麥基因型進行農(nóng)桿菌敏感性檢測分析，組織化學染色結果表明，河農(nóng)827的愈傷對農(nóng)桿菌侵染比較敏感，GUS基因瞬時表達率達9191％。利用混合『F交發(fā)計L8(4‘24)對河農(nóng)827進行遺傳轉(zhuǎn)化研究，得到最佳轉(zhuǎn)化條件為愈傷組織在誘導培養(yǎng)基W2上誘導培養(yǎng)6d，農(nóng)桿菌OD660=1時進行侵染3h。明確了篩選體系中抗生素的適宜添加濃度為25mg／LG418250mg／Lcarb；用含有抗生素的PCM液體培養(yǎng)基洗

5、滌共培養(yǎng)后的愈傷，能夠減小對愈傷造成的損傷，獲得較多的抗性愈傷；采用22℃條件下濾紙上培養(yǎng)3d的共培養(yǎng)方式以及農(nóng)桿菌侵染液中加入001％的表面活性劑聚醚F68，能夠減小愈傷褐化率，：肓助于提高小麥愈傷組織的轉(zhuǎn)化效率；在生根培養(yǎng)基上添加lm∥LIBA，解決了農(nóng)桿菌侵染后再生苗不易生根的難題，初步優(yōu)化了農(nóng)桿菌介導的小麥幼胚遺傳轉(zhuǎn)化體系。3利用優(yōu)化的小麥幼胚遺傳轉(zhuǎn)化體系將EeAP2一J『J『、OsDREB22抗逆轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)入小麥幼胚愈傷組織中