1、目的:和絕大多數(shù)惡性實體腫瘤一樣，血道轉(zhuǎn)移和淋巴管轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌主要的轉(zhuǎn)移途徑。在適合手術(shù)治療的結(jié)直腸癌患者中，有50％左右已經(jīng)發(fā)生了微血管或微淋巴管的轉(zhuǎn)移，這部分病人多數(shù)都會很快復(fù)發(fā)，5年生存率只有10％左右。因此，癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移擴散是結(jié)直腸癌致死的主要原因。本課題檢測了miR-19a在結(jié)直腸癌組織和結(jié)腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況，并在結(jié)腸癌細(xì)胞株中驗證miR-19a下調(diào)THBS1的基因表達(dá)對VEGF蛋白水平的影響及其對細(xì)胞增殖遷移能力的促進

2、作用，進一步研究結(jié)直腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移規(guī)律，揭示其內(nèi)在機制。
　　方法:本課題共分為四個部分。第一部分檢測結(jié)直腸癌組織及結(jié)腸癌細(xì)胞株中miR-19a的表達(dá)情況，包括以下實驗:①miR-19a在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況。收集臨床結(jié)、直腸癌標(biāo)本，并根據(jù)是否伴有轉(zhuǎn)移情況分為兩組，即有轉(zhuǎn)移組和無轉(zhuǎn)移組，用qRT-PCR的方法分別檢測癌組織中miR-19a的表達(dá)情況。②miR-19a在結(jié)腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況。選取不同惡性程度的結(jié)腸癌細(xì)胞株Lo

3、Vo，SW480和HT29，仍然用qRT-PCR方法分別檢測其miR-19a的表達(dá)情況。第二部分檢測結(jié)腸癌細(xì)胞株中THBS1和VEGF的表達(dá)情況。包括以下實驗:①qRT-PCR和Western-blot的方法分別檢測結(jié)腸癌細(xì)胞株中THBS1基因表達(dá)和蛋白表達(dá)的情況。②Western-blot檢測結(jié)腸癌細(xì)胞株中VEGF的表達(dá)情況。③免疫共沉淀的方法驗證結(jié)腸癌細(xì)胞株中THBS1蛋白與VEGF蛋白結(jié)合作用。第三部分驗證miR-19a對LoVo

4、細(xì)胞THBS1表達(dá)的調(diào)控及其對LoVo細(xì)胞增殖和遷移能力的影響。①構(gòu)建miR-19a的SiRNA質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染LoVo細(xì)胞。②驗證miR-19a表達(dá)抑制前后LoVo細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移能力的變化。第四部分通過雙熒光素酶實驗和雙熒光素酶突變實驗驗證miR-19a能夠與THBS1的3'端結(jié)合并抑制其表達(dá)。
　　結(jié)果:①結(jié)直腸癌組織中miR-19a呈高表達(dá)，且有轉(zhuǎn)移組的表達(dá)明顯高于無轉(zhuǎn)移組;結(jié)腸癌細(xì)胞株中miR-19a表達(dá)程度由高到低依次是LoV

5、o、SW480和HT29。②qRT-PCR實驗和Westem-blot結(jié)果均顯示結(jié)腸癌細(xì)胞株中THBS1的表達(dá)以HT29最高，SW480次之，LoVo最低，差異顯著;Western-blot實驗檢測結(jié)腸癌細(xì)胞株中VEGF的蛋白表達(dá)情況結(jié)果以LoVo最高，HCT119和SW480次之，HT29最低，差異顯著;③結(jié)腸癌細(xì)胞株LOVO、SW480和HT29中THBS1與VEGF的免疫共沉淀均呈陽性反應(yīng)。④成功構(gòu)建miR-19a的SiRNA質(zhì)粒

6、，并轉(zhuǎn)染LoVo細(xì)胞。劃痕試驗和Transwell實驗結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染SiRNA質(zhì)粒后LoVo細(xì)胞增殖和遷移能力均顯著下降，THBS1的表達(dá)明顯升高;⑤雙熒光素酶實驗和雙熒光素酶突變實驗結(jié)果顯示miR-19a能夠與THBS1的3'端結(jié)合并抑制其表達(dá)，當(dāng)miR-19a表達(dá)被抑制時，THBS1表達(dá)明顯升高。
　　結(jié)論:①無論是結(jié)直腸癌組織中，還是結(jié)腸癌細(xì)胞株中，miR-19a均呈高表達(dá)，說明miR-19a與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。②結(jié)

7、腸癌細(xì)胞株中，miR-19a的表達(dá)程度LoVo最高，SW480次之，HT29最低，這與細(xì)胞株的惡性程度一致，說明它與結(jié)直腸癌細(xì)胞的惡性程度密切相關(guān)。③結(jié)腸癌細(xì)胞株中，THBS1的表達(dá)程度與細(xì)胞株的惡性程度相反，與miR-19a的表達(dá)程度亦相反;VEGF的蛋白表達(dá)程度與結(jié)腸癌細(xì)胞株的惡性程度一致，與miR-19a的表達(dá)程度也一致;在結(jié)腸癌細(xì)胞株中，THBS1蛋白和VEGF蛋白的免疫共沉淀反應(yīng)均為陽性。這說明THBS1和VEGF能在結(jié)腸癌細(xì)