1、目的：
　　類風濕關節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性風濕免疫疾病，主要表現(xiàn)為反復的滑膜炎，導致多關節(jié)腫痛、變形、活動受限，往往演變成殘疾，是致殘率最高的關節(jié)疾病，嚴重影響了生活質量，是一種終身性疾病。目前RA的具體病因尚不明確。本課題根據(jù)濕性重濁粘滯，久濕形成毒，濕毒郁久化熱致瘀，阻滯經(jīng)脈筋肉，結合西方病因學說“體液論”，提出“濕毒入絡”可能導致RA的病因學理論。濕毒入絡，體液的流動或遷移可能刺激水

2、通道蛋白(AQPs)的異常表達;RA的活動期炎性滲出，滑膜充血水腫，也可能伴隨水的異常代謝。已有報道，AQPs在RA的發(fā)展過程中發(fā)揮著一定的作用，可介導其病理變化過程中的細胞遷移。另外，臨床上尚無根治RA的辦法，大多只停留在對癥治療，缺乏對因治療。本課題針對RA的病因病機“濕毒入絡”，擬方三黃一龍湯(SYD)聯(lián)合甲氨蝶呤(MTX)治療RA濕熱痹阻證，從臨床和動物實驗兩方面對RA發(fā)病機制和三黃一龍湯或聯(lián)合MTX的作用機理進行了研究。

3、>　　方法：
　　本課題的第一部分以RA濕熱痹阻證患者的外周血和滑膜液作為研究對象，從細胞因子、AQPs及JAK-STAT通路的信號因子等的表達及調控方面進行了初步研究，主要采用ELISA法檢測相關指標。第二部分復制出RA濕毒入絡動物模型，以大鼠的外周血、骨關節(jié)、肺、脾、腎臟等作為研究對象，從炎性因子、AQPs、Na+，K+-ATP酶、JAK-STAT通路的信號因子及關節(jié)病理組織學的變化及調控進行了深入研究，采用了ELISA法、R

4、T-PCR法及病理組織學等檢測方法。
　　結果：
　　一、RA濕熱痹阻證患者炎性因子、AQPs及JAK-STAT通路信號因子的變化及三黃一龍湯聯(lián)合MTX的調控作用及機制
　　1、RA濕熱痹阻證患者炎性因子的變化及三黃一龍湯聯(lián)合MTX的影響
　　(1)RA濕熱痹阻證患者活動期關節(jié)腫脹指數(shù)、壓痛指數(shù)以及ESR、CRP、DAS28明顯升高;采用SYD聯(lián)合MTX治療，其關節(jié)腫脹指數(shù)、壓痛指數(shù)及ESR、CRP、DAS28能

5、較快較好地改善。(2)RA濕熱痹阻證患者外周血TNF-α、IFN-γ較健康對照組顯著升高，滑膜液TNF-α、IFN-γ較外周血明顯升高。(3)采用SYD聯(lián)合MTX治療后TNF-α、IFN-γ顯著下降。
　　2、RA濕熱痹阻證患者AQPs的變化及三黃一龍湯聯(lián)合MTX的影響
　　(1)RA濕熱痹阻證患者外周血和滑膜液中AQP1、AQP2和AQP3的表達水平較健康者明顯降低。(2)外周血中AQP1、AQP2、AQP3表達略高于滑膜

6、液，以AQP1表達最多，AQP3次之，AQP2表達最少。(3)SYD聯(lián)合MTX可以使RA濕熱痹阻證患者低表達的AQP1、AQP2和AQP3上調。
　　3、RA濕熱痹阻證患者JAK-STAT通路信號因子的變化及三黃一龍湯聯(lián)合MTX的影響
　　(1)RA濕熱痹阻證患者STAT1、STAT3、PIAS1、PIAS3、SOCS-1、SOCS-3的表達水平較健康者都降低，其中STAT1表達高于STAT3，PIAS1表達高于PIAS3，

7、SOCS-1與SOCS-3表達相當。(2)RA外周血中STAT1、PIAS1、PIAS3、SOCS-1的表達高于滑膜液，而外周血中STAT3、SOCS-3與滑膜液中基本相當。(3)經(jīng)SYD聯(lián)合MTX治療，RA濕熱痹阻證患者外周血STAT1、STAT3、PIAS1、PIAS3、SOCS-1都下調，SOCS-3無明顯變化。
　　二、RA濕毒入絡模型大鼠炎性因子、AQPs、Na+,K+-ATPase、JAK-STAT通路信號因子及關節(jié)病

8、理組織學的變化及三黃一龍湯聯(lián)合MTX的調控作用及機制
　　1、RA濕毒入絡模型大鼠炎性因子的變化及三黃一龍湯或聯(lián)合MTX的影響
　　(1)RA濕毒入絡模型大鼠顯示血小板數(shù)、中性粒細胞比率和單核細胞比率較正常組明顯升高，淋巴細胞比率較正常組明顯降低。SYD及SYD聯(lián)合MTX能較好地降低中性粒細胞和單核細胞比率，上調淋巴細胞比率。(2)RA濕毒入絡模型大鼠外周血中IL-6和TNF-α表達水平較正常組都明顯降低;骨關節(jié)中IL-6和

9、TNF-α表達較正常組都明顯升高。SYD及SYD聯(lián)合MTX都能使外周血低下的IL-6和TNF-α上調，使骨關節(jié)中升高的IL-6和TNF-α下調。(3)RA濕毒入絡模型大鼠外周血中VEGF表達較正常組無差異，而其骨關節(jié)中VEGF表達較正常組明顯增多。SYD及SYD聯(lián)合MTX均能使骨關節(jié)中增多的VEGF減少。(4)RA濕毒入絡模型大鼠肺組織中TGF-β1mRNA的含量較正常組無差異;而其炎性關節(jié)周圍軟組織中TGF-β1mRNA的含量較正常組

10、明顯減少。SYD聯(lián)合MTX可促進炎性關節(jié)周圍軟組織中TGF-β1mRNA的表達。
　　2、RA濕毒入絡模型大鼠AQPs、Na+，K+-ATP酶的變化及三黃一龍湯或聯(lián)合MTX的影響
　　(1)RA濕毒入絡模型大鼠外周血和骨關節(jié)中AQP1、AQP2、AQP3表達較正常組均明顯降低。(2)RA濕毒入絡模型大鼠外周血中以AQP2表達最高，其次是AQP3;骨關節(jié)中以AQP3表達水平最高，其次是AQP2。(3)RA濕毒入絡模型大鼠肺組織

11、中AQP1mRNA的含量較正常組明顯減少，其腎組織AQP1mRNA的含量較正常組無差異。(4)RA濕毒入絡模型大鼠脾臟組織Na+，K+-ATP酶的活性較正常組明顯減退。(5)SYD及SYD聯(lián)合MTX都能較好地促進RA濕毒入絡模型大鼠外周血和骨關節(jié)中AQP1、AQP2、AQP3的表達，SYD聯(lián)合MTX還能顯著地增強肺組織AQP1mRNA的表達。(6)SYD及SYD聯(lián)合MTX能顯著地提高RA濕毒入絡模型大鼠脾臟組織Na+，K+-ATP酶的活

12、性。
　　3、RA濕毒入絡模型大鼠JAK-STAT通路信號因子的變化及三黃一龍湯或聯(lián)合MTX的影響
　　(1)RA濕毒入絡模型大鼠外周血中JAK1、JAK2、JAK3表達較正常組明顯降低;骨關節(jié)中JAK1、JAK3表達較正常組明顯升高;JAK2表達較正常組明顯降低。(2)RA濕毒入絡模型大鼠肺組織中JAK3mRNA的含量較正常組無差異;腎組織中JAK3mRNA的含量較正常組明顯增多。(3)RA濕毒入絡模型大鼠外周血和骨關節(jié)中

13、STAT1表達較正常組無差異。(4)RA濕毒入絡模型大鼠外周血中STAT3表達較正常組明顯降低;骨關節(jié)中STAT3表達較正常組無差異。(5)SYD及SYD聯(lián)合MTX可使RA濕毒入絡模型大鼠外周血中JAK1、JAK2、JAK3及骨關節(jié)中JAK2的表達上調。(6)SYD聯(lián)合MTX可使RA濕毒入絡模型大鼠骨關節(jié)中升高的JAK1、JAK3表達下調。(7)SYD及SYD聯(lián)合MTX能上調外周血STAT3的表達。(8)SYD及SYD聯(lián)合MTX能抑制腎

14、組織中JAK3mRNA的表達。
　　4、RA濕毒入絡模型大鼠關節(jié)病理組織學的變化及三黃一龍湯聯(lián)合MTX的影響
　　(1)RA濕毒入絡證模型大鼠關節(jié)組織病理學表現(xiàn)為巨噬細胞浸潤伴纖維組織增生。(2)SYD聯(lián)合MTX能抑制RA濕毒入絡模型大鼠關節(jié)纖維組織的增生和淋巴細胞的浸潤。
　　結論：
　　本研究證實了濕毒入絡是RA的基本病機。濕毒入絡誘導RA發(fā)病與AQPs、Na+，K+-ATP酶、JAK等密切相關，表現(xiàn)出外周血

15、、骨關節(jié)及肺脾腎臟等組織器官中AQP的亞型AQP1、AQP2、AQP3及AQP1mRNA表達減少，Na+，K+-ATP酶活性減退，骨關節(jié)促炎性細胞因子IL-6、TNF-α和血管內皮生長因子(VEGF)產生增多，軟組織TGF-β1mRNA減少，信號因子JAK1、JAK3及JAK3mRNA異常表達，關節(jié)巨噬細胞浸潤伴纖維組織增生。印證了肺主通調水道、脾主運化功能參與了RA濕毒入絡的發(fā)生發(fā)展過程。證明了三黃一龍湯及三黃一龍湯聯(lián)合MTX能較好地

16、降低RA的關節(jié)腫脹、壓痛指數(shù)，降低ESR、CRP、DAS28等炎癥指標，抑制外周血和骨關節(jié)炎性細胞因子IL-6、TNF-α、IFN-γ和血管內皮生長因子(VEGF)產生，促進TGF-β1mRNA分泌，增強外周血和骨關節(jié)AQP1、AQP2、AQP3及肺臟AQP1mRNA的表達，提高脾臟Na+，K+-ATP酶的活性，調控信號因子JAK1、JAK2、JAK3及STAT3等的表達。可作用于多組織器官，多靶點進行調節(jié)，增強組織細胞的代謝，緩解關節(jié)