1、大豆南方莖潰瘍病菌(Diaporthe phaseolorum var.meridionalis,DPM)、大豆北方莖潰瘍病菌(Diaporthe phaseolorum var.caulivora，DPC)和擬莖點(diǎn)種腐病菌(Phomopsislongicolla，PL)均為大豆上重要的莖部病原真菌。其中，大豆南方莖潰瘍病菌和大豆北方莖潰瘍病菌為我國(guó)公布的植物檢疫性病原真菌，在歐洲和北美洲的國(guó)家廣泛分布，嚴(yán)重影響大豆的生長(zhǎng)和產(chǎn)量。大豆擬

2、莖點(diǎn)種腐病菌是影響大豆生長(zhǎng)的重要病原菌，每年對(duì)我國(guó)的大豆生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失。對(duì)于三種病原菌的檢測(cè)工作，當(dāng)務(wù)之急就是一方面加強(qiáng)大豆南方莖潰瘍病菌和大豆北方莖潰瘍病菌的口岸檢疫，防止病原菌的入侵，另一方面要提高對(duì)大豆擬莖點(diǎn)種腐病菌的早期快速診斷技術(shù)水平，在病菌侵染初期準(zhǔn)確診斷出病原菌的存在，降低經(jīng)濟(jì)損失。
　　傳統(tǒng)的以傳統(tǒng)的以ITS（內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)）為靶序列的分子檢測(cè)無(wú)法快速準(zhǔn)確區(qū)分大豆北方莖潰瘍病菌、大豆南方莖潰瘍病菌和大豆擬莖點(diǎn)種腐病

3、菌等近似種。筆者在大豆北方莖潰瘍病菌靶標(biāo)序列篩選中，發(fā)現(xiàn)了翻譯延伸因子(translation elongationfactor1α，tef1α)序列。翻譯延伸因子是信使核糖核酸翻譯促進(jìn)多肽鏈延伸的蛋白質(zhì)因子，其在原核、真核生物中均有存在，具有高度的特異性，常常被用于多種病原菌的分類鑒定上。通過(guò)目標(biāo)病原菌與其相似種比對(duì)發(fā)現(xiàn)，三種病原菌在tef1α序列上都有很好的特異性，適合作為分子檢測(cè)的靶標(biāo)?；诃h(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-media

4、tedisothermal amplification，LAMP)，以tef1α為靶序列，針對(duì)三種病原物分別設(shè)計(jì)LAMP特異性引物，建立了基于顏色判定的簡(jiǎn)單、快速和靈敏的檢測(cè)方法，在特異性的基礎(chǔ)上分別進(jìn)行了靈敏度驗(yàn)證、人工接種大豆植株檢測(cè)試驗(yàn)和實(shí)際樣本檢測(cè)試驗(yàn)。
　　在大豆南方莖潰瘍病菌和大豆北方莖潰瘍病菌的LAMP檢測(cè)中，64℃等溫條件下進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)60 min，反應(yīng)結(jié)束后，加入SYBR greenⅠ染料，根據(jù)染料顏色變化判

5、定擴(kuò)增結(jié)果。引物特異性驗(yàn)證試驗(yàn)中，只有目標(biāo)菌株中擴(kuò)增到梯形條帶，同時(shí)加入SYBR greenⅠ染料后可觀察到綠色熒光的陽(yáng)性反應(yīng);而在其他供試菌株中均沒(méi)有出現(xiàn)梯形條帶，加入SYBR greenⅠ染料后則保持橙色的陰性反應(yīng)。該技術(shù)在大豆南方莖潰瘍病菌和大豆北方莖潰瘍病菌的最低檢測(cè)限為10pg·μL-1和1pg·μL-1目標(biāo)菌純DNA。在對(duì)分別人工接種了大豆南方莖潰瘍病菌和大豆北方莖潰瘍病菌病菌的大豆植株發(fā)病組織的檢測(cè)中，DPM-LAMP和D

6、PC-LAMP技術(shù)能夠檢測(cè)出所有人工接種發(fā)病大豆植株中的目標(biāo)菌。筆者又對(duì)口岸截獲的大豆病殘?bào)w進(jìn)行了人工添加子囊孢子的試驗(yàn)，DPM-LAMP和DPC-LAMP技術(shù)能夠分別在10g進(jìn)口大豆夾帶的大豆植株殘?bào)w中最低檢測(cè)出大豆南方莖潰瘍病菌和大豆北方莖潰瘍病菌的50個(gè)子囊孢子和10個(gè)子囊孢子。結(jié)果顯示，該方法的建立為大豆南方莖潰瘍病菌和大豆北方莖潰瘍病菌的檢疫以及其所致病害的快速診斷提供了新的技術(shù)。
　　在擬莖點(diǎn)種腐病菌的PL-LAMP檢

7、測(cè)中，在擴(kuò)增反應(yīng)前加入染料HNB（羥基萘酚藍(lán)），作為反應(yīng)指示劑，根據(jù)HNB的顏色變化判定反應(yīng)結(jié)果，引物特異性驗(yàn)證試驗(yàn)中，54株分離自不同省份的擬莖點(diǎn)種腐病菌菌株能觀察到天藍(lán)色的陽(yáng)性反應(yīng)，而從其他真菌和疫霉中反應(yīng)管保持紫色的陰性反應(yīng)。在靈敏度檢測(cè)中，PL-LAMP技術(shù)最低檢測(cè)限為100pg·μL-1目標(biāo)菌純DNA。在對(duì)人工接種了大豆擬莖點(diǎn)種腐病菌的大豆植株發(fā)病組織的檢測(cè)中，PL-LAMP技術(shù)能夠檢測(cè)出所有人工接種發(fā)病豆苗中的目標(biāo)菌。在田間

8、應(yīng)用方面，對(duì)來(lái)自江蘇、安徽和武漢的疑似發(fā)病的大豆樣本進(jìn)行檢測(cè)。LAMP檢測(cè)技術(shù)的陽(yáng)性率為58/116(50.0％)、利用傳統(tǒng)的病原分離法進(jìn)行分離的陽(yáng)性率為36/116(31.0％)，結(jié)果顯示，PL-LAMP技術(shù)明顯的提高了檢測(cè)效率。
　　高通量檢測(cè)是目前病原菌檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展方向，發(fā)展高通量的檢測(cè)技術(shù)對(duì)于基層實(shí)驗(yàn)室和出入境口岸檢疫具有重要的意義。對(duì)本論文關(guān)于我國(guó)口岸的兩種植物檢疫性病原物:大豆北方莖潰瘍病菌（D.phaseoloru

9、m var.caulivora）、大豆南方莖潰瘍病菌（D.phaseolorum var.meridionalis）的LAMP檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行改良優(yōu)化，連同南京農(nóng)業(yè)大學(xué)吳旭東關(guān)于大豆莖褐腐病菌（Phialophora gregata f.sp.sojae）的LAMP檢測(cè)技術(shù)，結(jié)合八連排反應(yīng)管建立了一種能夠同時(shí)檢測(cè)一個(gè)樣本中3種病原菌的高通量檢測(cè)體系。在水浴鍋內(nèi)64℃擴(kuò)增70min，加入染料HNB（羥基萘酚藍(lán)），作為反應(yīng)指示劑，根據(jù)HNB的顏

10、色變化判定反應(yīng)結(jié)果，如果存在目標(biāo)菌，反應(yīng)管顏色變?yōu)樘焖{(lán)色，如果不合目標(biāo)菌，反應(yīng)液為紫色。應(yīng)用該檢測(cè)體系，對(duì)口岸截獲來(lái)自3個(gè)不同國(guó)家的進(jìn)口大豆殘?bào)w進(jìn)行帶菌檢測(cè)，結(jié)果顯示，9份樣品中檢測(cè)到了2份樣品含有大豆北方莖潰瘍病菌，1份樣品中含有大豆莖褐腐病菌。本研究建立的高通量檢測(cè)體系，具有快速、不需要特殊儀器和肉眼判斷結(jié)果的優(yōu)勢(shì)，適合基層單位的實(shí)驗(yàn)室和檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)開(kāi)展分子檢測(cè)和病害診斷。
　　綜上所述，本研究在國(guó)內(nèi)外首次采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技