1、食品安全突發(fā)事件頻率高是近年來食品安全問題的一個顯著特點(diǎn)，產(chǎn)毒素性大腸桿菌導(dǎo)致的腹瀉是公共衛(wèi)生學(xué)上具有重要意義的人畜共患病之一。為確保食品安全與食品貿(mào)易，需要大力加強(qiáng)食品檢驗(yàn)的力度，迫切需要建立快速、靈敏的產(chǎn)毒素性大腸桿菌的檢驗(yàn)方法。環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是利用4條特殊設(shè)計(jì)的引物和具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件下特異、高效、快速地擴(kuò)增DNA的新技

2、術(shù)。該技術(shù)以其特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速、準(zhǔn)確和操作簡便等優(yōu)點(diǎn)在核酸的科學(xué)研究、疾病的診斷和轉(zhuǎn)基因食品檢測等領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用。
　　 本課題采用LAMP技術(shù)檢測產(chǎn)毒素性大腸桿菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)，靈敏度高，特異性強(qiáng)，檢測方法簡便，耗時短且檢測成本低。針對產(chǎn)毒素性大腸桿菌不耐熱腸毒素(heat labile enterotoxin, LT)基因保守序列為靶序列運(yùn)用在

3、線引物設(shè)計(jì)軟件(https://primerexplorer.jp/lamp3.0.0/index.html)設(shè)計(jì)LAMP引物，同時驗(yàn)證了引物的特異性及可行性。建立了檢測ETEC不耐熱腸毒素基因的LAMP方法。對反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、鎂離子濃度等擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化，確定25μL的LAMP反應(yīng)體系為：內(nèi)引物（FIP和BIP）各1.2μM，外引物（F3和B3）各0.2μM，0.5mMdNTP，4mMMgCl2，10×BstDNA聚合酶反應(yīng)緩沖液

4、，7.2U的BstDNA聚合酶大片段，2μLDNA模板和用滅菌雙蒸水補(bǔ)足體系。LAMP反應(yīng)過程是首先在62℃水浴鍋中反應(yīng)30min，然后將其放入80℃水浴鍋中，水浴3min終止反應(yīng)，通過肉眼觀察有無白色焦磷酸鎂沉淀，即可判斷是否發(fā)生了LAMP反應(yīng)。此外，取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，觀察梯形條帶，以證實(shí)是否發(fā)生了LAMP反應(yīng)。
　　 為了比較LAMP檢測產(chǎn)毒素性大腸桿菌的靈敏度和人工污染檢出限，以PCR方法作對照。結(jié)果表明，

5、LAMP檢測產(chǎn)毒素性大腸桿菌的檢出限為32.9CFU/mL，人工污染的生豬肉的檢出限為55CFU/g。采用試劑盒提取DNA，從樣品處理到報告結(jié)果，耗時1h。對照PCR耗時3h，檢測產(chǎn)毒素性大腸桿菌的檢出限為3.29×104CFU/mL，人工污染產(chǎn)毒素性大腸桿菌的生豬肉的檢出限為5.5×104CFU/g。LAMP的靈敏度是PCR的1000倍。
　　 通過對實(shí)際樣品進(jìn)行檢測，確定LAMP方法敏感性為100％，特異性為70％，符合率為