1、動物研究發(fā)現(xiàn)幾乎所有臨床所用的靜脈麻醉藥在腦發(fā)育的關(guān)鍵時期可引起神經(jīng)退行性變和異常的突觸發(fā)生，進(jìn)而導(dǎo)致后期行為表現(xiàn)改變和學(xué)習(xí)認(rèn)知功能障礙。丙泊酚是一種新型靜脈麻醉藥，通過激活γ-氨基丁酸受體(Gamma Amino Acid Butyric Acid Receptor,GABAR)及抑制N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-Methyl-D Aspartate Receptor,NMDAR)而發(fā)揮作用，因起效快、蘇醒迅速、且功能恢復(fù)完善而普遍

2、應(yīng)用于麻醉的誘導(dǎo)、維持以及ICU鎮(zhèn)靜。丙泊酚被發(fā)現(xiàn)同樣存在神經(jīng)毒性作用，新生期的丙泊酚暴露可抑制神經(jīng)發(fā)生，引起神經(jīng)元凋亡，并且有報道顯示新生期的丙泊酚暴露導(dǎo)致后期的學(xué)習(xí)及記憶損害。麻醉藥物在兒童這一特殊群體中可能存在的神經(jīng)毒性作用已引起廣泛的關(guān)注，進(jìn)一步研究以深入了解其致病機(jī)制及制定預(yù)防措施迫在眉睫。
　　小腦位于大腦半球后方，覆蓋在腦橋及延髓之上，橫跨在中腦延髓之間，是后腦的最大部分。小腦和大腦皮層一樣具有典型的板層結(jié)構(gòu)，由分子

3、層(Molecular Layer，ML)、蒲肯野細(xì)胞層(Purkinje Cell Layer,PCL)及顆粒層(Granule Cell Layer,GCL)構(gòu)成。神經(jīng)元分化、形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞遷移在小腦的發(fā)育中被精確地調(diào)控，由此形成小腦正常的板層結(jié)構(gòu)和神經(jīng)環(huán)路。而小腦的功能則建立在正確的神經(jīng)元聯(lián)系以及小腦環(huán)路中傳入及傳出纖維的整合之上。小腦不僅僅有運(yùn)動方面的功能，更參與認(rèn)知、情感、執(zhí)行等高級功能。小腦深部的核團(tuán)整合蒲肯野細(xì)胞信息后，發(fā)

4、出傳出纖維投射至丘腦、皮層、皮層下、腦干、下丘腦等區(qū)域，由此參與廣泛的高級神經(jīng)功能，在發(fā)育關(guān)鍵期小腦也能通過這些通路影響腦其它區(qū)域的神經(jīng)發(fā)生及功能形成。與此同時，小腦的損傷，特別是先天性的或兒童期的損傷，可能引起神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙性疾病，包括自閉癥、注意力缺陷多動癥及進(jìn)行性失語等。而最近研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚能抑制小腦蒲肯野細(xì)胞神經(jīng)活動，影響小腦神經(jīng)環(huán)路，這提示丙泊酚可能以小腦為靶點發(fā)揮神經(jīng)毒性作用。
　　目的:
　　丙泊酚作為全身靜

5、脈麻醉藥，引起機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)，并能通過下丘腦-垂體-腎上腺軸(Hypothalamic Pituitary Gonadal Axis，HPA)影響神經(jīng)內(nèi)分泌內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。丙泊酚可直接作用于下丘腦，引起其相應(yīng)神經(jīng)核團(tuán)神經(jīng)元活動改變。在發(fā)育窗口期的內(nèi)環(huán)境紊亂可直接影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元發(fā)生、突觸形成、神經(jīng)元聯(lián)系及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形成，并且可能導(dǎo)致機(jī)體重要部位對神經(jīng)毒性藥物易損性增加。探索丙泊酚對小腦及下丘腦的影響，有利于發(fā)現(xiàn)更多的作用靶點，并進(jìn)一步

6、認(rèn)識丙泊酚神經(jīng)毒性機(jī)制，將為預(yù)防及制定更好的麻醉方案提供新的策略和理論依據(jù)。
　　方法:
　　小鼠出生后7天(Postnatal day7，P7)給予藥物處理，分別為30mg/kg及60mg/kg丙泊酚，對照組以溶劑脂肪乳同體積注射（腹腔注射）。P8時收取標(biāo)本，通過比較對照組及藥物處理組小腦大體組織形態(tài)差異，觀察蒲肯野細(xì)胞、顆粒神經(jīng)元、伯格曼細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)變化，以明確丙泊酚對新生期小腦發(fā)育的影響;采用5-溴脫氧尿嘧啶(5-B

7、romo-2'-deoxyuridine，BrdU)在P8時標(biāo)記小腦新生神經(jīng)元并在P10及P14時觀察標(biāo)記的神經(jīng)元在外顆粒層(External Granular Layer,EGL)、分子層(ML)、內(nèi)顆粒層(Internal Granular Layer，IGL)的分布，以研究顆粒神經(jīng)元P8-P10、P14遷移情況;并采用蛋白印跡分析Notch通路表達(dá)水平以深入探索丙泊酚影響小腦發(fā)育的可能途徑與機(jī)制。同時，用c-Fos免疫組化篩選及確

8、定丙泊酚對下丘腦的激活部位，進(jìn)一步分析丙泊酚處理后相關(guān)神經(jīng)肽精氨酸加壓素(Arginine Vasopressin，AVP)及糖皮質(zhì)激素受體(Glucocorticoid Receptor，GR)表達(dá)水平以觀察機(jī)體應(yīng)激及內(nèi)分泌改變，并用免疫組化方法觀察小膠質(zhì)細(xì)胞活化水平以明確丙泊酚對下丘腦的整體影響。
　　結(jié)果:
　　1、丙泊酚對新生小鼠小腦發(fā)育的影響
　　(1)P8小腦蘇木素-伊紅(Hematoxylin-eosin

9、，HE)染色中，對照組、丙泊酚低劑量組、丙泊酚高劑量組三組間小腦矢狀切面面積無明顯差異，第Ⅸ葉片外顆粒層厚度三組間無明顯差異;
　　(2)P8小腦CB免疫熒光染色中，丙泊酚高劑量組小腦蒲肯野細(xì)胞數(shù)量較對照組顯著減少(P＜0.05)，蒲肯野細(xì)胞樹突長度明顯變短(P＜0.05)，丙泊酚低劑量組與對照組間無差異;
　　(3)P8小腦NeuN免疫熒光染色中，對照組、丙泊酚低劑量組、丙泊酚高劑量組三組間小腦內(nèi)顆粒層顆粒神經(jīng)元數(shù)量無明顯

10、差異;
　　(4)P8小腦BLBP及GFAP免疫熒光染色中，丙泊酚低、高劑量組BLBP陽性纖維數(shù)量較對照組均明顯減少(P＜0.01，P＜0.01)，而比較GFAP陽性纖維數(shù)量高劑量組較對照組明顯減少(P＜0.05)，其白質(zhì)區(qū)域星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增多(P＜0.05);
　　(5)P8小腦CB和GFAP雙標(biāo)免疫熒光染色中，丙泊酚高劑量組較對照組蒲肯野細(xì)胞樹突與伯格曼纖維連接點數(shù)量明顯減少(P＜0.01);
　　(6)P10小

11、腦HE染色中，對照組、丙泊酚低劑量組、丙泊酚高劑量組三組間小腦矢狀切面面積無明顯差異，第Ⅸ葉片外顆粒層厚度低劑量組、高劑量組均較對照組明顯增厚(P＜0.01，P＜0.01);
　　(7)P10小腦BrdU免疫熒光染色中，丙泊酚高劑量組中新生顆粒神經(jīng)元較對照組在外顆粒層比例明顯增多(P＜0.01)，在內(nèi)顆粒層比例明顯減少(P＜0.05)，而低劑量組與對照組間無明顯差異。而P14小腦BrdU染色中各組顆粒神經(jīng)元數(shù)量在外顆粒層、分子層及

12、內(nèi)顆粒層中分布無明顯差異;
　　(8)P8小腦蛋白印跡分析中，丙泊酚低劑量、高劑量組中Jagged1蛋白表達(dá)水平較對照組均明顯下調(diào)(P＜0.01，P＜0.01)，Notch1蛋白也均明顯下調(diào)(P＜0.05，P＜0.01)，且高劑量組Notch1蛋白表達(dá)較低劑量組下調(diào)(P＜0.01)。
　　2、丙泊酚對新生小鼠下丘腦的影響
　　(1)P8下丘腦c-Fos免疫組化染色中，丙泊酚低、高劑量組中室旁核被激活神經(jīng)元數(shù)量較對照組均

13、顯著增加(P＜0.05，P＜0.001)，且高劑量組較低劑量組顯著增加(P＜0.01);
　　(2)P8下丘腦室旁核AVP免疫熒光染色及蛋白印跡分析中，丙泊酚高劑量組表達(dá)AVP大細(xì)胞神經(jīng)元數(shù)量較對照組明顯增加(P＜0.01)，AVP蛋白表達(dá)水平較對照組及低劑量組均明顯上調(diào)(P＜0.01，P＜0.05)，而低劑量組與對照組間無顯著差異;
　　(3)P8下丘腦室旁核GR免疫熒光染色及蛋白印跡分析中，丙泊酚高劑量組GR陽性細(xì)胞數(shù)量

14、較對照組、低劑量組均明顯上升(P＜0.001，P＜0.05)，而GR蛋白表達(dá)水平丙泊酚低、高劑量組較對照組均明顯上調(diào)(P＜0.05，P＜0.01)，且高劑量組較低劑量組上調(diào)(P＜0.05);
　　(4)P8下丘腦Iba1免疫組化染色中，丙泊酚低、高劑量組小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較對照組在下丘腦背內(nèi)側(cè)區(qū)(DMHA)(P＜0.05，P＜0.01)、腹內(nèi)側(cè)區(qū)(VMHA)(P＜0.05，P＜0.001)、外側(cè)區(qū)(LHA)(P＜0.01，P＜0.01