1、偽狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)可引起野生動物和多種家畜的偽狂犬病,尤其是豬偽狂犬病,給中國乃至世界養(yǎng)豬業(yè)都造成了巨大的經(jīng)濟損失。與其它α-皰疹病毒亞科的成員一樣,偽狂犬病具有神經(jīng)嗜性和潛伏感染等特征,是一種具有重要研究意義的動物病毒性傳染病。目前,預(yù)防和控制該病的主要措施仍然是免疫接種疫苗。雖然它可以減少潛伏感染的建立,但是卻不能完全阻止病毒的感染和散毒,也不能阻止建立潛伏感染。若要是能夠從動物自身的角度出發(fā)

2、,培育出具有抗偽狂犬病的轉(zhuǎn)基因動物,無疑對養(yǎng)殖業(yè)來說,是劃時代的進步。
　　 PRV基因組編碼膜蛋白與其它皰疹病毒相似,gD基因的質(zhì)粒作為免疫原可以誘導(dǎo)細胞毒性淋巴細胞反應(yīng),是偽狂犬病毒入侵靶細胞所必需的一種糖蛋白。Nectin-1基因是α皰疹病毒的受體,介導(dǎo)偽狂犬病毒進入豬的上皮細胞和神經(jīng)細胞。Nectin-1的N端有一個類似免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域與偽狂犬病毒糖蛋白基因gD相結(jié)合,進而導(dǎo)致病毒囊膜與細胞膜融合,核衣殼進入

3、細胞,造成機體感染發(fā)病。所構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因動物模型,正是利用nectin-1的這一特點,首先使轉(zhuǎn)基因動物表達nectin-1基因胞外區(qū)的可溶性片段,在偽狂犬病毒感染細胞前先與gD基因競爭性結(jié)合,阻斷gD基因與細胞上的nectin-1基因受體相結(jié)合,從而達到阻止偽狂犬病毒感染細胞的目的,增強轉(zhuǎn)基因動物抗偽狂犬病的能力。
　　 鑒于以上研究背景,本試驗分別通過轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法獲得表達nectin-1基因胞外區(qū)可溶性片段的PK-15細胞系

4、,為構(gòu)建具有抗偽狂犬病的轉(zhuǎn)基因豬模型奠定基礎(chǔ)。主要工作包括:
　　 1.PRV受體nectin-1基因的克隆與分子特征分析
　　 本試驗根據(jù)GenBank上已登錄的豬nectin-1基因序列(登錄號 AF308632),設(shè)計1對引物P1、P2,本試驗首先運用RT-PCR的方法從豬肝臟組織中克隆到了豬nectin-1基因,并采用生物信息學(xué)軟件對其核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列進行了比較分析。
　　 豬nectin-1

5、基因與犬、人、恒河猴、黑猩猩、家鼠、牛、馬的nectin-1基因核苷酸序列同源性分別為92％、92％、91％、91％、89％、93％和93％；推導(dǎo)氨基酸序列的同源性分別為100％、95％、67％、100％、100％、100％和100％。在執(zhí)行功能的胞外區(qū)具有很高的保守性,序列分析中的3個N-糖基化位點和7個半胱氨酸殘基都位于胞外區(qū),且在不同物種間也都具有很高的保守性,這從一定程度上解釋了PRV可感染豬、羊、牛、貓、犬等35種脊椎動物,具

6、有宿主范圍廣的因為。也為后期利用nectin-1胞外區(qū)來生產(chǎn)抗偽狂犬病毒的轉(zhuǎn)基因動物提供了理論依據(jù)。
　　 2.豬nectin-1胞外區(qū)基因的克隆與原核表達
　　 本試驗同樣運用Prime5軟件設(shè)計1對引物P3、P4,以從豬肝臟組織中提取總RNA為模板,RT-PCR擴增豬nectin-1胞外區(qū)完整編碼區(qū)序列,并將其克隆至pGEX-6p-1原核表達載體,成功構(gòu)建pGEX-6p-1-nectin-1-ecto質(zhì)粒,在IPTG

7、37℃條件下誘導(dǎo)表達3h后,在大腸桿菌BL21表達體系中,表達豬的nectin-1胞外區(qū)基因的蛋白。SDS-PAGE電泳檢測可以得到一條大小約62kDa的與GST標簽相融合的表達條帶,并且主要以不溶性的包涵體形式存在。再以抗6個組氨酸的單抗為一抗,通過Western blot檢測證實了表達蛋白的特異性后,以表達產(chǎn)物為抗原免疫3只新西蘭白兔,制備nectin-1-ecto的多克隆抗體。40天后動脈放血采集少量血清,通過ELISA試驗測定其

8、效價為1:640。
　　 3.表達豬nectin-1胞外區(qū)基因的PK-15細胞系的構(gòu)建
　　 構(gòu)建了表達豬nectin-1胞外區(qū)基因的真核表達質(zhì)粒pCA-nectin-1-ecto,運用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染PK-15細胞,并在3周內(nèi)用G418來篩選穩(wěn)定表達豬nectin-1胞外區(qū)的PK-15細胞系。并采用流式細胞儀、間接免疫熒光和Western blot從蛋白質(zhì)水平上證實豬nectin-1胞外區(qū)基因在所構(gòu)建的細胞系中獲得表達。在

9、PK-15細胞系抑制PRV病毒增殖試驗中,跟正常PK-15細胞相比較,所篩選的PK-15細胞系具有明顯的抑制PKV病毒增殖的能力。
　　 4.慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的PK-15細胞系的構(gòu)建
　　 在眾多逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中,本試驗運用HIV慢病毒載體作為構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物的載體。同時利用293ft細胞做為制備慢病毒粒子的包裝細胞。本試驗在轉(zhuǎn)染293ft包裝細胞時,同時轉(zhuǎn)染除攜帶有外源目的基因pLenti-7.3CA質(zhì)粒之外的另外三個輔助質(zhì)粒

10、pLP1、pLP2和pLP/VSVG,使其表達四個HIV慢病毒的結(jié)構(gòu)基因。通過在包裝細胞中裝配后分泌到細胞上清中,收集細胞上清、超離獲得HIV慢病毒粒子。將超離獲得慢病毒病毒粒子按照5×108pfu/ml,用低速離心的方法轉(zhuǎn)導(dǎo)PK-15細胞,72h后通過倒置式熒光顯微鏡觀察,挑取陽性細胞克隆擴大培養(yǎng),從而獲得慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的能夠穩(wěn)定表達豬pLenti7.3CA-nectin-1-ecto的PK-15細胞系。
　　 5.兩種細胞系抑制

11、病毒增殖實驗的比較
　　 本試驗通過接毒試驗、一步法增長曲線試驗和Western blot方法三個方面來驗證兩種細胞系抑制病毒的增殖試驗。在接毒試驗中,兩種PK-15細胞系與正常的PK-15細胞系比較,具有明顯的抑制病毒增殖的作用。而兩種細胞系之間相比較,差異性并不明顯。在一步法增長曲線試驗中,將正常PK-15細胞和用上述兩種方式成功構(gòu)建的PK-15細胞系按照相同的量各培養(yǎng)于7瓶T-25細胞瓶中,24h后接種5MOI計量的病毒濃

12、度為1×108的PRV-Ea株的病毒,按照0h、3h、6h、9h、12h、18h、24h共7個時間點,收集上述三種細胞的細胞上清液。測定毒價,發(fā)現(xiàn)通過慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)法獲得的PK-15細胞系在第9h開始有效的抑制病毒的增殖,而用轉(zhuǎn)染法獲得的PK-15細胞系在第12h才開始對PRV的增殖有抑制作用。利用Western blot方法驗證轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)導(dǎo)空載體的PK-15細胞和用上述兩種方式成功構(gòu)建的PK-15細胞系相關(guān)蛋白表達量的情況。檢測結(jié)果顯示:在

13、36 kDa處,兩種細胞系的上清液都大量表達了目的蛋白,并且在57 kDa處也少量表達了細胞自身的nectin-1全蛋白,而轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)導(dǎo)空載體的PK-15細胞,僅僅只在57 kDa處有少量nectin-1全蛋白表達。以上結(jié)果更近一步說明兩種細胞系抗病毒的效果,并且兩者之間的差異不顯著。
　　 6.慢病毒載體在轉(zhuǎn)基因動物中的試驗
　　 本試驗采用慢病毒感染法,選取湖北白豬,采用懷孕母豬自體移植的方式,將上述獲得的慢病毒病毒粒