1、偽狂犬病毒（Pesudorabies virus，PRV）是皰疹病毒科α皰疹病毒亞科的一員，能夠引起多種家畜和野生動物的偽狂犬病，豬為該病毒的貯存宿主。偽狂犬病在豬群中的爆發(fā)和流行給全世界的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，雖然個別國家在該病的根除上已經(jīng)取得了一定的成效，但在許多其它國家和地區(qū)仍然呈地方性流行，所以在養(yǎng)豬業(yè)上偽狂犬病仍然是疾病控制的一個重點。PRV和所有的其它皰疹病毒一樣，基因組的表達呈級聯(lián)方式調節(jié)，生命周期中都經(jīng)歷一個潛伏感

2、染時期。許多皰疹病毒都編碼幾個立即早期基因和更多的早期基因，然而PRV只有一個立即早期基因IE180，已經(jīng)報道的早期基因只有EP0、TK和UL54三個。另外，雖然PRV的宿主譜很廣，而且和人的一些皰疹病毒同源性很高，但是對人類并不敏感，所以它逐漸被病毒學家們用做一個研究皰疹病毒分子生物學的模式生物。
　　 本研究通過對PRV的立即早期基因IE180和早期基因EP0的調控功能的研究，驗證了IE180基因對EP0基因和TK基因的正調

3、控作用；研究了IE180基因和EP0基因的自調控；發(fā)現(xiàn)了PRVEa株和Fa株的EP0基因（EP0/Ea、EP0/Fa）對IE180基因和TK基因的負調控作用；探討了EP0中特定氨基酸的改變對其調控功能的影響；初步把EP0的負調控必需功能域定位在環(huán)指結構域部位。具體研究內容如下：
　　 1．PRV Ea株IE180、EP0和TK三個基因啟動子的克隆及活性驗證
　　 通過PCR擴增的方法從PRV Ea株基因組DNA中克隆了I

4、E180、EP0和TK三個基因的啟動子序列，并進行了序列測定。用這些啟動子序列分別置換本研究中所構建的兩個報告基因質粒（pcDNA-EGFP，pcDNA-lacZ）的CMV啟動子，以驗證啟動子活性。瞬時轉染實驗證明所克隆的三個基因的啟動子序列均具有啟動子活性，可以在沒有病毒任何其它基因表達的情況下啟動報告基因的轉錄。
　　 2．IE180基因對EP0、TK基因的轉錄激活
　　 IE180基因增強TK基因的表達已經(jīng)得到了證

5、實，但是對EP0基因的調控尚無報道。本研究通過IE180基因的真核表達質粒與EP0或TK基因啟動子的報告基因質粒共轉染細胞，發(fā)現(xiàn)IE180基因的表達確實能夠顯著增強EP0基因和TK基因啟動子的轉錄，符合預期結果。
　　 3．IE180基因和EP0基因的自調控
　　 以前的研究證實PRV Ka株IE180基因在轉染細胞中的表達能夠抑制自身啟動子的活性，表現(xiàn)出一種負的自調控機制。本研究在用PRV Ea株IE180基因啟動子的

6、報告基因質粒和IE180基因真核表達質粒共轉染細胞時，發(fā)現(xiàn)Ea株的IE180基因也同樣具有負的自調控現(xiàn)象。另外本研究發(fā)現(xiàn)PRV Ea株的早期基因EP0在轉染細胞中也顯著抑制了其自身啟動子的活性，表現(xiàn)出對自身的負調控現(xiàn)象，之前對PRV的研究中尚沒有類似的報道。
　　 4．PRVFa株EP0基因的克隆及序列分析
　　 通過PCR擴增的方法從PRV Fa株基因組DNA中克隆了完整的EP0基因，并進行了序列測定。將推導出的的PR

7、V Fa株EP0氨基酸序列與Ea株的EP0序列進行比較，發(fā)現(xiàn)它們均編碼409個氨基酸。相對于日本分離株YS-81株的EP0（EP0/YS-81）而言，它們都在相同的位置缺失了一個氨基酸，而且存在6個相同的氨基酸突變，但是EP0/Ea比EP0/Fa又多出了3個氨基酸的突變。
　　 5．EP0/Ea和EP0/Fa對IE180、TK基因的負調控
　　 實驗初期，在用PRV Ea株EP0基因的真核表達質粒分別與IE180和TK基

8、因啟動子的報告基因質粒共轉染細胞時，發(fā)現(xiàn)Ea株EP0的表達能夠顯著抑制正180和TK基因的啟動子的活性，表現(xiàn)為一種負調控。為了驗證PRV Fa株的EP0是否也具有同樣的功能，克隆了PRV Fa株EP0的全基因序列。隨后的共轉染實驗證明，PRVFa株的EP0基因的表達同樣顯著抑制了IEl80和TK基因啟動子的活性。
　　 6．EP0/Ea、EP0/Fa的緊接環(huán)指結構域的兩個氨基酸的變化對其調控功能的影響
　　 根據(jù)對不同毒

9、株EP0的氨基酸序列分析和疏水性分析，推測緊接環(huán)指結構域的兩個氨基酸的變化可能會較大的影響EP0的調控功能。為了證實這個推測，采用DNA合成置換的方法對EP0/Fa和EP0/Fa基因中的第85、86位氨基酸進行回復突變。進一步的實驗表明，當對EP0/Fa進行回復突變后，其對IE180和TK啟動子的抑制功能明顯減弱；而在EP0/Fa中，這兩個氨基酸的改變對其抑制效應并沒有產(chǎn)生顯著的變化。這些結果說明，EP0中第85、86位氨基酸的改變確實

10、能夠影響整個EP0的調控功能。
　　 7．PRV Ea株和Fa株EP0基因的功能域定位
　　 采用PCR擴增的方法構建了EP0/Fa、EP0/Fa的不同區(qū)段的缺失突變體，進一步構建對應的真核表達質粒。將這些突變體的真核表達質粒分別與IE180和TK基因啟動子的報告基因質粒共轉染細胞，做流式分析。分析結果發(fā)現(xiàn)，在EP0/Fa和EP0/Fa中環(huán)指結構域的存在和完整對其發(fā)揮負調控功能來說是必需的，另外氨基酸第1-113的突變體

11、表現(xiàn)出顯性隱性的特性。
　　 8．PRV IE180基因特異性siRNA分子的篩選
　　 先后根據(jù)已知的PRV TNL株和在本研究中測出的Ea株IE180基因序列設計合成了5個siRNA分子，構建相應的表達質粒，與IE180-EGFP融合蛋白真核表達質粒共轉染細胞進行篩選，結果發(fā)現(xiàn)所設計的5個siRNA分子均無顯著的抑制效果。推測可能是由于目標序列結構的復雜性等所造成，靶位點可能被目標RNA的二級結構或者高度折疊區(qū)域掩蓋