1、目的：本實(shí)驗(yàn)室在2003年從海洋生物沙蠶消化道中分離出嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌D2，該菌能夠大量胞外分泌某蛋白酶(protease of S.maltophilia，SMP)，且純度高；課題組前期研究已獲得了其完整的編碼基因(smp)，并分析發(fā)現(xiàn)其可能通過(guò)Ⅱ型分泌系統(tǒng)分泌。為了能夠明確D2株SMP蛋白的分泌表達(dá)機(jī)制，為該菌的進(jìn)一步開發(fā)與利用奠定基礎(chǔ)，本課題組擬利用同源重組技術(shù)使外源基因替換D2菌中的amp基因，通過(guò)研究突變菌株分泌表達(dá)生物活性物

2、質(zhì)的情況，對(duì)D2株SMP蛋白表達(dá)機(jī)制和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌Ⅱ型分泌系統(tǒng)的基因結(jié)構(gòu)及功能進(jìn)行分析。因此，本文旨在構(gòu)建用于D2株smp基因敲除的重組自殺質(zhì)粒pDS132NotI-A-tet-B；同時(shí)在上述過(guò)程中獲得了D2株Ⅱ型分泌系統(tǒng)GSP基因簇GspF和GspE兩個(gè)編碼基因的完整序列并進(jìn)行分析。
　　 方法1.通過(guò)藥敏試驗(yàn)(MicsroScan W/A-40全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)檢測(cè)和稀釋法)檢測(cè)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌D2株的耐藥性

3、，以篩選同源重組實(shí)驗(yàn)方案中合適自殺質(zhì)粒和篩選標(biāo)記基因。2.根據(jù)smp基因序列和GenBank收錄的K279a和R551株的高保守序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)基因移步法分別PCR擴(kuò)增獲得其上下游的基因序列。3.對(duì)在smp上游序列中發(fā)現(xiàn)的Ⅱ型分泌系統(tǒng)GSP基因簇GspF和GspE兩個(gè)基因進(jìn)行序列和生物信息學(xué)分析。4.根據(jù)獲得的smp基因的上、下游基因序列設(shè)計(jì)引物，并引入合適的酶切位點(diǎn)，分別擴(kuò)增獲得同源臂A和B；同時(shí)依據(jù)Genbank上收錄的pBR32

4、2的四環(huán)素抗性基因(tet)設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增獲得篩選標(biāo)記tet的完整ORF基因片段；以上各引物設(shè)計(jì)時(shí)同時(shí)引入適當(dāng)長(zhǎng)度的互補(bǔ)序列，以用于SOE-PCR連接。5.SOE-PCR連接擴(kuò)增同源臂A、基因tet和同源臂B，得到三段的嵌合基因序列A-tet-B。6.分別用NotI酶切自殺質(zhì)粒pDS132NotI和pMD18T-A-tet-B，連接構(gòu)建重組自殺質(zhì)粒pDS132NotI-A-tet-B，并進(jìn)行測(cè)序分析。
　　 結(jié)果1.兩種藥敏試驗(yàn)

5、方法檢測(cè)顯示D2株對(duì)氯霉素和四環(huán)素敏感，對(duì)多種抗生素耐藥，故選擇pDS132質(zhì)粒(catr)和DH5αλpir株(cat-)為同源重組的載體系統(tǒng)，選擇tet基因?yàn)橥粗亟M的篩選標(biāo)記。2。在D2株贓因5’拼接三段序列含有兩個(gè)完整開放讀碼框架(ORF)，分別為1200bp GspF基因(GenBank收錄號(hào)GU377212.1)和1434bpGspE基因(GenBank收錄號(hào)HM151387)。在GenBank中BLAST分析發(fā)現(xiàn)，D2株與

6、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌R551-3株的GspF基因及氨基酸序列同源性分別為93％和98％；GspE基因及氨基酸序列同源性分別為92％和99％。3.酶切鑒定證實(shí)SOE-PCR產(chǎn)物A-tet-B與自殺質(zhì)粒pDS132NotI成功連接，測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)同源臂A序列與設(shè)計(jì)完全一致，篩選基因tet部分與GenBank收錄質(zhì)粒pBR322的四環(huán)素抗性基因(tet)完全一致，同源臂B片段與原序列只有5個(gè)堿基不同，保真性達(dá)98％。
　　 結(jié)論檢測(cè)出D2株