1、近年來(lái)，隨著廣譜抗菌藥物、免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素的應(yīng)用以及介入性醫(yī)療操作的開(kāi)展，嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌感染發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，已成為醫(yī)院獲得性肺部感染的重要病原菌之一，由嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌所引起的醫(yī)院內(nèi)暴發(fā)流行已見(jiàn)報(bào)道，對(duì)其分子流行病學(xué)進(jìn)行研究是預(yù)防和控制醫(yī)院內(nèi)感染的重要基礎(chǔ)，它利用分子生物學(xué)方法來(lái)判斷菌株之間的親緣關(guān)系，揭示其流行趨勢(shì)，發(fā)現(xiàn)暴發(fā)流行的潛在危險(xiǎn)因素，進(jìn)而及時(shí)切斷流行菌株的來(lái)源及傳播途徑。 嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌存在兩種β內(nèi)酰

2、胺酶，對(duì)亞胺培南天然耐藥，而水解氨基糖苷類的天然修飾酶使其對(duì)氨基糖苷類藥物耐藥。此外，由于膜蛋白的低通透性及主動(dòng)外排機(jī)制，使臨床應(yīng)用的多數(shù)抗生素都有耐藥的報(bào)道，對(duì)部分抗生素甚至高度耐藥，為多重耐藥菌，臨床可選擇的藥物十分有限。復(fù)方新諾明、氟喹諾酮類藥物、替卡西林/克拉維酸、少數(shù)三代頭胞菌素是治療嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌可選擇的有效藥物，尤其是新一代氟喹諾酮藥物對(duì)其呈現(xiàn)較高的敏感性。目前，關(guān)于減少新一代氟喹諾酮藥物的耐藥、延長(zhǎng)其臨床使用壽命已成為

3、醫(yī)學(xué)界日益關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。針對(duì)如何限制細(xì)菌耐藥的發(fā)生，國(guó)外學(xué)者Drlica等提出了防耐藥變異濃度(MPC)的概念。MPC是指防止一步突變菌株被選擇性富集擴(kuò)增所需的最低抗菌藥物濃度，不僅能夠評(píng)價(jià)抗菌藥物的抗菌效力，而且可反映藥物抑制耐藥突變菌株生長(zhǎng)的能力。該理論的提出對(duì)傳統(tǒng)的基于最低抑菌濃度(MIC)的抗菌藥物應(yīng)用策略提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，旨在指導(dǎo)臨床醫(yī)生在關(guān)注藥物抗菌效力的同時(shí)，更應(yīng)關(guān)注藥物的預(yù)防耐藥變異的能力。 細(xì)菌獲得氟喹諾酮類

4、藥物耐藥的機(jī)制有三個(gè)方面：藥物作用靶位的結(jié)構(gòu)基因突變；細(xì)菌主動(dòng)外排系統(tǒng)活性增強(qiáng)；細(xì)胞膜通透性下降。氟喹諾酮類藥物的作用靶位是細(xì)菌體內(nèi)的Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶即DNA促旋酶和Ⅳ型拓?fù)洚悩?gòu)酶，它們對(duì)DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄過(guò)程中拓?fù)錁?gòu)象的轉(zhuǎn)變有重要作用。藥物通過(guò)分別與這兩種酶以及DNA形成三元復(fù)合物而抑制它們的活性，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡。嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌內(nèi)源性和獲得性多重耐藥機(jī)制與存在多重外排泵有關(guān)，已發(fā)現(xiàn)的外排泵有SmeABC和SmeDEF，后者對(duì)多種毒性物

5、質(zhì)和包括氟喹諾酮類的多種抗生素有外排作用。氰氯苯腙(CCCP)和利血平是主動(dòng)外排泵的抑制劑，CCCP是通過(guò)抑制外排泵的能量來(lái)源起作用，利血平為某些外排泵的底物，競(jìng)爭(zhēng)性抑制外排泵對(duì)抗生素的泵出。 本課題對(duì)沈陽(yáng)地區(qū)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌臨床分離株進(jìn)行了脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)同源性分析，以探討其分子流行病學(xué)特點(diǎn)；測(cè)定了4種氟喹諾酮藥物對(duì)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的MPC，以指導(dǎo)臨床抗生素的選擇和應(yīng)用；采用泵抑制劑對(duì)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌氟喹諾酮類藥物抗

6、菌活性進(jìn)行干預(yù)，并對(duì)臨床分離株和實(shí)驗(yàn)室耐藥菌株的DNA促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ進(jìn)行PCR擴(kuò)增及DNA堿基序列分析，以探討嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌對(duì)氟喹諾酮類藥物耐藥與主動(dòng)外排泵及靶位基因的關(guān)系。 實(shí)驗(yàn)材料與方法一、實(shí)驗(yàn)材料1.菌株來(lái)源(1)臨床分離株：92株嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌臨床分離株來(lái)源于2003年9月至2005年12月沈陽(yáng)市4家三級(jí)甲等綜合性醫(yī)院(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬二院、中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬一院、解放軍總醫(yī)院、二○二醫(yī)院)臨床標(biāo)本。 (

7、2)實(shí)驗(yàn)室耐藥菌株：將環(huán)丙沙星以MIC為基準(zhǔn)，按濃度倍比遞增的方式制備7個(gè)濃度梯度的含藥胰酶大豆瓊脂平皿。將10株對(duì)環(huán)丙沙星敏感的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌用肉湯增菌法增至3×1010CFU/ml，使每個(gè)藥物濃度平皿的細(xì)菌總接種量為1.2×1010CFU。于37℃孵育72h后，在無(wú)細(xì)菌菌落生長(zhǎng)的最小濃度前一個(gè)濃度平皿上篩選耐藥菌株。每株敏感菌篩選1株耐藥菌，共10株。 2.實(shí)驗(yàn)試劑：LB肉湯培養(yǎng)基、蛋白酶K、XbaⅠ限制性內(nèi)切酶、λLad

8、der、D0015-10G的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠、莫西沙星標(biāo)準(zhǔn)品、環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品、左氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品、洛美沙星標(biāo)準(zhǔn)品、Muller-Hinton肉湯培養(yǎng)基、MH瓊脂培養(yǎng)基、胰酶大豆瓊脂培養(yǎng)基、PCR引物、柱離心式PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒、CCCP標(biāo)準(zhǔn)品、利血平標(biāo)準(zhǔn)品。 3.實(shí)驗(yàn)儀器：電熱恒溫培養(yǎng)箱、BD比濁儀、低溫高速臺(tái)式離心機(jī)、小型三用水箱、細(xì)菌振蕩培養(yǎng)箱、PTC-200PCR擴(kuò)增儀、DYY-Ⅲ型電泳槽、GIS-700D數(shù)碼圖像掃描分

9、析系統(tǒng)、CHEF-MapperXA型脈沖電泳儀。 二、實(shí)驗(yàn)方法1.染色體組DNA脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)實(shí)驗(yàn)菌株為92株臨床分離株。采用LB肉湯振蕩培養(yǎng)集菌，用蛋白酶K進(jìn)行DNA原位純化，用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ進(jìn)行原位消化，使用CHEFMapperXA系統(tǒng)電泳，紫外透射儀上拍照。 2.最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定采用標(biāo)準(zhǔn)瓊脂二倍稀釋法，測(cè)定5種氟喹諾酮藥物對(duì)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的MIC。 3.防耐藥變異濃度(MPC

10、)的測(cè)定測(cè)定4種氟喹諾酮藥物對(duì)31株嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的MPC。用新鮮MH肉湯將振蕩培養(yǎng)的細(xì)菌濃度調(diào)整為3×1010CFU/ml。以MIC為基準(zhǔn)，倍比遞增藥物濃度，制備7個(gè)濃度梯度的含不同藥物濃度的胰酶大豆瓊脂平皿。使每個(gè)藥物濃度平皿的細(xì)菌總接種量為1.2×1010CFU。于37℃孵育，孵育72h后仍無(wú)細(xì)菌菌落生長(zhǎng)的最小濃度即為MPC。 4.靶位基因的序列分析DNA模板的制備：應(yīng)用煮沸法制備DNA模板。PCR擴(kuò)增條件：反應(yīng)體系50

11、μl，含5μl的10×緩沖液；4μldNTP，1μlTaqDNA聚合酶，引物各2μl，4μlDNA模板。 PCR擴(kuò)增參數(shù)：94℃預(yù)變性5min后，94℃1min，54℃1min，72℃1min，共循環(huán)30次，最后72℃再延伸5min。 PCR產(chǎn)物純化：應(yīng)用柱離心試劑盒進(jìn)行純化。 序列分析：純化后PCR產(chǎn)物由上海Sengon生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，均為正反雙向測(cè)序。 5.泵抑制劑對(duì)MIC的影響在含氟喹

12、諾酮類藥物二倍稀釋濃度的MH瓊脂平皿中加入CCCP至5mg/L，加入利血平至20mg/L。測(cè)定泵抑制劑存在的情況下氟喹諾酮類藥物對(duì)92株嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的MIC。同時(shí)制備僅含泵抑制劑的培養(yǎng)基，作為生長(zhǎng)對(duì)照。比較應(yīng)用泵抑制劑前后菌株對(duì)抗菌藥物MIC的變化，MIC降至原值的1/4或更低判定為外排泵陽(yáng)性株。 結(jié)果：一、分子流行病學(xué)特點(diǎn)92株嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌經(jīng)XbaⅠ對(duì)染色體進(jìn)行酶切后，產(chǎn)生8～16條DNA片段，范圍約為30～420kb

13、左右。92株嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌呈現(xiàn)多克隆構(gòu)成模式，共有63個(gè)克隆。其中，有10個(gè)克隆(A～J)出現(xiàn)了克隆傳播，共39株，每個(gè)克隆涉及2～10個(gè)菌株?？寺涉及10個(gè)菌株，分離間期最長(zhǎng)達(dá)24個(gè)月，且出現(xiàn)了醫(yī)院間的傳播?？寺中來(lái)自中國(guó)醫(yī)大二院的9株菌中有5株來(lái)自ICU病房，3株來(lái)自呼吸病房?？寺有7個(gè)菌株，經(jīng)過(guò)4次傳播后，環(huán)丙沙星的MIC值由1mg/L升高至8mg/L。 二、氟喹諾酮對(duì)31株嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的MIC莫西沙星的抗菌活

14、性最強(qiáng)，敏感率為100％；其次為左氧氟沙星，敏感率為90.3％；洛美沙星的敏感率為71％，；而環(huán)丙沙星組敏感率僅為29％。與瓊脂稀釋法比較，應(yīng)用紙片法測(cè)定環(huán)丙沙星抗菌活性，其敏感率增加，耐藥率降低，兩種方法比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。 三、氟喹諾酮對(duì)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的MPCMPC由小至大依次為莫西沙星＜左氧氟沙星＜環(huán)丙沙星＜洛美沙星。莫西沙星和左氧氟沙星的MPC集中在32mg/L，而洛美沙星和環(huán)丙沙星的MPC集中在128m

15、g/L。 四、靶位基因測(cè)序結(jié)果與嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC13637比較，28株臨床分離菌靶位基因gyrA、gyrB、parC均有核苷酸替換，但無(wú)氨基酸替換。有18株菌出現(xiàn)parE氨基酸的替換，占64.3％，共有6個(gè)位點(diǎn)發(fā)生替換。10株實(shí)驗(yàn)室耐藥菌株與其親本野生株進(jìn)行同源比較，其氨基酸序列完全一致。將28株臨床分離菌分為環(huán)丙沙星敏感組及環(huán)丙沙星耐藥組，比較各替換位點(diǎn)陽(yáng)性率，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 五、外排泵對(duì)氟喹諾酮耐藥表

16、型的影響CCCP和利血平抑制實(shí)驗(yàn)共篩選出泵陽(yáng)性菌株27株。主動(dòng)外排泵不僅存在于氟喹諾酮耐藥菌株，而且也存在于氟喹諾酮敏感菌株，但對(duì)耐藥菌株影響更大。按外排泵抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將92株臨床分離菌分成泵陽(yáng)性組和泵陰性組，采用樣本構(gòu)成比的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法比較外排泵對(duì)氟喹諾酮耐藥表型的影響，結(jié)果表明泵陽(yáng)性組左氧氟沙星、洛美沙星、環(huán)丙沙星敏感率降低，洛美沙星、環(huán)丙沙星耐藥率增加，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)論1.同一醫(yī)療單元，環(huán)境的污染是克隆傳播的重

17、要原因。不同醫(yī)療單元，醫(yī)源性傳播是重要的傳播途徑?？寺鞑ナ羌?xì)菌耐藥的原因之一。 2.常規(guī)單藥治療，氟喹諾酮可誘發(fā)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌耐藥的發(fā)生。紙片法測(cè)定嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的敏感性不能代替瓊脂法MIC測(cè)定。環(huán)丙沙星對(duì)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的敏感性不能代替其它喹諾酮藥物的敏感性。 3.嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌臨床分離株gyrA、gyrB、parC基因無(wú)氨基酸替換，parE基因替換頻率高，但與氟喹諾酮耐藥無(wú)關(guān)。 4.主動(dòng)外排泵抑制劑C