1、動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是一種嚴(yán)重威脅人類健康的常見病、多發(fā)病，也是冠心病、心肌梗塞及腦卒中的主要病因。目前研究認(rèn)為AS是由多種致病因素引起的以內(nèi)皮細(xì)胞損傷為基礎(chǔ)、以血管的慢性炎癥為特征的病理過程。
　　 目前研究認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化斑塊分為穩(wěn)定性斑塊和不穩(wěn)定性斑塊兩類。不穩(wěn)定性斑塊的突出特征是具有較大的脂質(zhì)核、較薄的纖維帽和大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，膠原和平滑肌細(xì)胞數(shù)量少，是引起包括不穩(wěn)定型心絞痛、急性心肌梗

2、塞和心源性猝死在內(nèi)的急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)的病理基礎(chǔ)。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定性與斑塊的內(nèi)部成分變化密切相關(guān)，斑塊內(nèi)的巨噬細(xì)胞、泡沫細(xì)胞、T-淋巴細(xì)胞等的多種炎癥細(xì)胞通過分泌大量細(xì)胞因子及蛋白水解酶降解細(xì)胞外基質(zhì)并促進(jìn)平滑肌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而增加斑塊易損性。
　　 腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin angiotensin system，RAS)由一系列酶、肽類、激素及其受體所組成，在A

3、S發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是RAS重要的末端活性產(chǎn)物，通過作用于1型受體(AT1)和2型受體(AT2)而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。腎素可特異性地切割血管緊張素原N-端第10與第11位氨基酸之間的肽鍵，催化血管緊張素原轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅰ，后者再轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅱ，從而激活RAS。這是RAS級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的限速步驟。腎素是腎素原在激活酶催化作用下生成的一種蛋白酶。腎素作為AngⅡ上游的RAS成員，在心腦血管遺傳學(xué)研究中越來越受

4、到人們的重視，其基因多態(tài)性成為高血壓、冠心病和腦卒中的疾病的候選基因。近幾年隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)腎素和其前體腎素原，通過與腎素原受體結(jié)合，經(jīng)由兩種途徑發(fā)揮生物學(xué)作用，一種是依賴血管緊張素途徑，即催化血管緊張素原轉(zhuǎn)化為AngⅠ，進(jìn)而在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用；另一種是非血管緊張素途徑，即通過不生成血管緊張素(Ang)的方式直接激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路產(chǎn)生生物學(xué)作用。然而目前對(duì)于腎素/腎素原和其受體-腎素原受體的研究和認(rèn)識(shí)還不全面深入，在對(duì)人腎素

5、基因與疾病關(guān)系的研究中以與原發(fā)性高血壓相關(guān)性研究較多，探討其與動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)系的研究報(bào)道很少。因此本研究首先構(gòu)建了腎素基因過表達(dá)的腺相關(guān)病毒載體，于體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中觀察對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化PAS系統(tǒng)及相關(guān)炎癥因子、信號(hào)通路的影響，初步探討腎素在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中的作用，為動(dòng)脈粥樣硬化的治療提供新的理論依據(jù)和技術(shù)策略。
　　 越來越多的證據(jù)表明血脂代謝紊亂和腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的激活在AS病理過程中起了重要作用。氧化型低密

6、度脂蛋白(oxidized low densitylipoprotein，OX-LDL)促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表面的血管緊張素Ⅱ1型受體(AT1R)的表達(dá)。植物血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體-1(Lectin-like oxidizedlow density lipoprotein receptor-1，LOX-1)在內(nèi)皮細(xì)胞損傷、單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附及泡沫細(xì)胞形成過程中起了重要作用，是內(nèi)皮細(xì)胞損傷的早期標(biāo)志物。LOX-1在動(dòng)脈粥樣硬

7、化中的作用機(jī)制尚不甚清楚，有研究報(bào)道，Ox-LDL與LOX-1的結(jié)合開始于NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子的激活，同時(shí)增加細(xì)胞內(nèi)ROS的形成。單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附并遷移到內(nèi)皮下組織是AS早期的病理特征，單核細(xì)胞趨化因子(monocyte chemoattractant protein，MCP)-1作為一種重要的趨化因子在此病理過程中起重要作用。聯(lián)合使用HMG-CoA還原酶抑制劑他汀類和AT1R拮抗劑(ARB)常用于治療臨床上伴有血脂代謝紊亂的高血

8、壓病人，并可以進(jìn)一步減輕其AS程度，本文在觀察了腎素過表達(dá)與AS關(guān)系后又觀察并初步探討了聯(lián)合用藥對(duì)AS炎癥斑塊及相關(guān)因子的影響。
　　 第一部分人腎素基因腺相關(guān)病毒表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定
　　 目的:
　　 構(gòu)建人腎素基因腺相關(guān)病毒表達(dá)載體，并包裝純化出高滴度病毒，為研究腎素高表達(dá)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化影響的后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.構(gòu)建pDC316-Ren質(zhì)粒；
　　 以原始質(zhì)粒

9、REN為模版設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增Ren片段，經(jīng)SalⅠ和BglⅡ雙酶切連接入載體質(zhì)粒pDC316，轉(zhuǎn)化得到pDC316-Ren質(zhì)粒。酶切電泳和測(cè)序鑒定。
　　 2.以pSNAV2.0-tdRFP質(zhì)粒構(gòu)建pSNAV2.0-tdRFP-mCMV-Ren；以pDC316-Ren質(zhì)粒為模版設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增mcmv-ren-polyA片段，經(jīng)BamHI單酶切PCR產(chǎn)物和載體質(zhì)粒PSNAV2.0-tdRFP，連接，轉(zhuǎn)化得到pSNAV2.0-tdRFP-

10、mCMV-Ren質(zhì)粒。酶切電泳和測(cè)序鑒定。
　　 3.rAAV2-Ren-RFP的制備純化，鑒定及滴度測(cè)定。
　　 將2.0-Ren-RFP質(zhì)粒用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，經(jīng)G418選擇培養(yǎng)后，將此混合細(xì)胞株命名為BHK/HIF-2。將rAAV2-Ren-RFP的生產(chǎn)細(xì)胞株經(jīng)HSV1-rc/△UL2感染(MOI為0.1)后，包裝產(chǎn)生重組rAAV2-Ren-RFP，PCR擴(kuò)增目的基因加以鑒定。

11、鑒定正確的rAAV2-Ren-RFP用地高辛標(biāo)記的CMV探針點(diǎn)雜交方法檢測(cè)病毒液中rAAV2-Ren-RFP的物理滴度(以病毒基因組數(shù)/mL，vg/ml表示)。
　　 結(jié)果:
　　 1.重組質(zhì)粒pDC316-Ren經(jīng)SalⅠ和BglⅢ雙酶切預(yù)期產(chǎn)生大小分別3.8kb和1.2kb左右兩條帶，電泳結(jié)果與預(yù)期相符，該質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定正確，送測(cè)序正確。
　　 2.重組質(zhì)粒pSNAV2.0-tdRFP-mCMV-Ren經(jīng)Ba

12、mHI單酶切預(yù)期產(chǎn)生大小分別為7.8kb和1.9kb左右兩條帶，而電泳結(jié)果與預(yù)期相符，該質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定正確，測(cè)序鑒定正確。
　　 3.重組rAAV2-Ren-RFP病毒經(jīng)PCR鑒定，能夠特異擴(kuò)增出1.9kb左右大小的目的基因條帶，證明該重組腺相關(guān)病毒攜帶有目的基因Ren。
　　 4.用地高辛標(biāo)記的CMV探針點(diǎn)雜交方法檢測(cè)病毒液中rAAV2-Ren-RFP的物理滴度(以病毒基因組數(shù)/mL，vg/ml表示)。通過計(jì)算Ren的

13、拷貝數(shù)、再乘以與其雜交信號(hào)強(qiáng)度一致的病毒液樣品的稀釋倍數(shù)，得出rAAV2-Ren-RFP的物理滴度為8.3×1011 vg/ml。
　　 結(jié)論:
　　 1.成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pDC316-Ren和pSNAV2.0-tdRFP-mCMV-Ren；
　　 2.成功構(gòu)建重組rAAV2-Ren-RFP病毒載體；
　　 3.包裝純化出高滴度病毒，為后續(xù)研究工作奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二部分腎素基因過表達(dá)對(duì)動(dòng)脈粥

14、樣硬化影響的體內(nèi)外研究
　　 目的:
　　 于體內(nèi)外觀察腎素過表達(dá)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化中RAS系統(tǒng)和相關(guān)炎癥因子的影響，探討腎素在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展過程中的作用，為進(jìn)一步進(jìn)行動(dòng)脈粥樣硬化治療的研究提供理論依據(jù)和技術(shù)策略。
　　 方法:
　　 1.32只雄性新西蘭大白兔先高脂喂養(yǎng)一周，然后行腹主動(dòng)脈內(nèi)膜損傷術(shù)，并繼續(xù)高脂喂養(yǎng)12周形成AS斑塊，于12周末隨機(jī)分為3組即高脂組、rAAV2-RFP空載體組和rAAV2-

15、Ren-RFP腎素基因表達(dá)組，于腹主動(dòng)脈斑塊明顯處分別局部轉(zhuǎn)染5×1010vg/只的rAAV2-RFP或rAAV2-Ren-RFP。16周末處死動(dòng)物取材，HE和油紅0染色分別觀察AS斑塊程度和血管內(nèi)膜脂質(zhì)情況；免疫組化檢測(cè)AS斑塊內(nèi)腎素是否成功表達(dá)及各組巨噬細(xì)胞、VCAM-1的表達(dá)；RT-PCR檢測(cè)各組VCAM-1、MCP-1mRNA的表達(dá)；Western blot檢測(cè)各組間腎素表達(dá)水平。
　　 2.原代培養(yǎng)HUVECs，經(jīng)傳代

16、，依據(jù)細(xì)胞形態(tài)及抗Ⅷ因子抗體鑒定后，取生長(zhǎng)良好的3-8代用于實(shí)驗(yàn)。預(yù)先加入100MOIrAAV2-RFP孵育HUVECs，分別于24、48、72小時(shí)熒光顯微鏡下監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度，選取熒光最強(qiáng)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)--RT-PCR及Western blot檢測(cè)，分析轉(zhuǎn)染rAAV2-Ren-RFP后的renin及炎癥因子VCAM-1、MCP-1等的表達(dá)，分析高表達(dá)的renin對(duì)AS相關(guān)炎癥因子蛋白和mRNA表達(dá)的影響。Western blot檢

17、測(cè)高表達(dá)的腎素對(duì)相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.HE染色顯示腎素基因表達(dá)組血管內(nèi)膜增厚，脂滴積聚；免疫組化顯示腎素成功于轉(zhuǎn)染斑塊處表達(dá)，且腎素基因轉(zhuǎn)染組的斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增多，炎癥因子VCAM-1表達(dá)增加，斑塊潛在不穩(wěn)定性增加；RT-PCR檢測(cè)AS相關(guān)炎癥因子VCAM-1、MCP-1mRNA表達(dá)增加。Western blot顯示腎素基因轉(zhuǎn)染組腎素蛋白表達(dá)亦增加。
　　 2.rAAV2-RF

18、P轉(zhuǎn)染HUVECs不同時(shí)間發(fā)現(xiàn)，于48小時(shí)熒光最強(qiáng)，即選取48小時(shí)收獲細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。Western blot檢測(cè)顯示腎素基因轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的腎素蛋白大量表達(dá)，炎癥因子蛋白表達(dá)量增多；RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞的mRNA表達(dá)水平，與蛋白表達(dá)趨勢(shì)一致。Western blot檢測(cè)信號(hào)通路蛋白表達(dá)顯示p-ERK、p-P38MAPK、p-JNK表達(dá)增多。
　　 結(jié)論:
　　 體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)顯示，轉(zhuǎn)染rAAV2-Ren-RFP組與rAA

19、V2-RFP組相比，前者炎癥因子的基因及蛋白表達(dá)均增加，表明腎素表達(dá)量增多時(shí)，AS相關(guān)炎癥因子表達(dá)水平亦增加，斑塊潛在不穩(wěn)定性增加。調(diào)控RAS上游的腎素基因，或許可以為動(dòng)脈粥樣硬化的治療提供新的技術(shù)策略。
　　 第三部分 HMG-CoA還原酶抑制劑和ARB聯(lián)合應(yīng)用對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊及相關(guān)炎癥因子的影響
　　 目的:
　　 體內(nèi)研究聯(lián)合應(yīng)用HMG-CoA還原酶抑制劑他汀類和ARB對(duì)AS斑塊炎癥及早期AS的影響，并進(jìn)

20、一步探討其分子機(jī)制。
　　 方法:
　　 將1.5-1.63kg重的雄性新西蘭大白兔36只先行一周的正常飲食，然后被隨機(jī)分為4組：高脂組(CH，n=9)即單純飼以高脂飲食(1％膽固醇+5％豬油顆粒)；氯沙坦組(L，n=9)即高脂飲食+氯沙坦(25mg/kg/d)；氟伐他汀組(F，n=9)即高脂飲食+氟伐他汀(10mg/kg/d)；氟伐他汀+氯沙坦組(F+L，n=9)即高脂飲食+氟伐他汀(10mg/kg/d)+氯沙坦(25

21、mg/kg/d)。另取8只1.5-1.63kg重的雄性新西蘭大白兔作為陰性對(duì)照組飼以正常飲食，以觀察高脂飲食致AS斑塊的病變程度。16周末收集兔耳緣靜脈血檢測(cè)血脂水平變化，剝離完整胸主動(dòng)脈，HE染色觀察AS斑塊病變程度和內(nèi)膜厚度；油紅O染色檢測(cè)AS斑塊中脂質(zhì)含量；免疫組化染色法檢測(cè)并分析細(xì)胞因子MCP-1在斑塊中含量以及巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)程度和血管平滑肌細(xì)胞(SMCs)數(shù)量變化；RT-PCR檢測(cè)各組MCP-1mRNA水平變化；Western

22、blot檢測(cè)各組p38MAPK蛋白含量變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.各組血脂水平變化：16周末兔耳緣靜脈取血，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)氯沙坦組(L)與單純高脂組(CH)相比，血總膽固醇和LDL-膽固醇水平無顯著性差異，氟伐他汀組(F)與單純高脂組(CH)相比，血總膽固醇和LDL-膽固醇水平明顯降低(P<0.01)，氟伐他汀+氯沙坦組(F+L)與單純高脂組(CH)相比，血總膽固醇和LDL-膽固醇水平亦明顯降低(P<0.01)，提示氯沙坦

23、單獨(dú)使用并沒有明顯的降血脂作用。
　　 2.各組內(nèi)膜厚度(I)和內(nèi)膜厚度/中膜厚度(I/M)變化：與單純高脂組(CH)相比，氟伐他汀組(F)和氯沙坦組(L)內(nèi)膜厚度(I)和內(nèi)膜厚度/中膜厚度(I/M)均明顯降低(P<0.01)，而氟伐他汀+氯沙坦組(F+L)的I和I/M進(jìn)一步降低(分別與F、L組相比，P<0.01)，提示兩藥聯(lián)合使用對(duì)AS具有協(xié)同抑制效應(yīng)。
　　 3.組織學(xué)檢測(cè)
　　 HE染色發(fā)現(xiàn)，正常飲食組內(nèi)膜

24、結(jié)構(gòu)正常，無斑塊形成；CH組胸主動(dòng)脈內(nèi)膜明顯增厚，管腔變窄，鏡下可見大量泡沫細(xì)胞；F組和L組的內(nèi)膜亦增厚，但與CH組相比，AS程度明顯減輕；F+L組則進(jìn)一步減輕了AS的程度。油紅O染色，CH組內(nèi)膜脂質(zhì)含量豐富；F組和L組的脂質(zhì)含量明顯減少；F+L組脂質(zhì)含量進(jìn)一步減少。
　　 4.免疫組化：CH組增厚的內(nèi)膜中可見大量巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，F(xiàn)組和L組均明顯減少了巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)(P<0.01)，F(xiàn)+L組巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)程度進(jìn)一步減輕(P<0.01)

25、；各組間SMCs表達(dá)無明顯差異。免疫組化顯示，CH組增厚的內(nèi)膜中可見大量MCP-1陽性顆粒表達(dá)，與CH組相比，F(xiàn)組和L組的MCP-1陽性顆粒表達(dá)明顯減少(P<0.01)，而F+L組MCP-1陽性顆粒表達(dá)進(jìn)一步減少(P<0.05)。
　　 5.RT-PCR：與CH組相比，F(xiàn)組和L組的MCP-1mRNA水平明顯降低(P<0.01)，F(xiàn)+L組的MCP-1mRNA水平進(jìn)一步降低(P<0.05)。
　　 6.Western blo

26、t：與CH組相比，F(xiàn)組和L組的p38MAPKs表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)，F(xiàn)+L組的p38MAPKs表達(dá)水平進(jìn)一步降低(P<0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.氯沙坦單獨(dú)使用并無顯著降低AS血脂的作用；
　　 2.HMG-CoA還原酶抑制劑他汀類和ARB的聯(lián)合應(yīng)用，明顯減輕了AS斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和內(nèi)膜的厚度面積，減輕了AS程度并穩(wěn)定了易損斑塊。
　　 3.兩者聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)一步降低了AS斑塊內(nèi)MCP