1、目的:骨骼肌成肌細(xì)胞心肌內(nèi)移植可以改善心臟收縮功能,但移植后心律失常的發(fā)生率明顯增高,成肌細(xì)胞移植的致心律失常作用可能與其分化狀態(tài)有關(guān)。本研究擬構(gòu)建可表達(dá)針對miRNA-181前體莖環(huán)結(jié)構(gòu)的小干擾RNA(siRNA)重組慢病毒表達(dá)載體,敲除miRNA-181上調(diào)成肌細(xì)胞分化抑制蛋白、miRNA-181的靶蛋白Hox-A11,觀察miRNA-181敲除對成肌細(xì)胞缺血心肌內(nèi)移植后心律失常的影響。
　　 方法：設(shè)計(jì)合成針對pre-mi

2、RNA-181莖環(huán)結(jié)構(gòu)的siRNA片段:siR-1,針對pre-miRNA-181隨機(jī)部位的對照siRNA:siR-2、siR-3、FAM標(biāo)記的陰性對照siRNA(NC)以及miRNA-181抑制劑,分別轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞系L6,轉(zhuǎn)染后誘導(dǎo)分化48小時,提取總蛋白和總RNA,用蛋白印記法(Western blot)檢測Hox-A11蛋白水平,Real--Time PCR檢測Hox-A11 mRNA水平。根據(jù)篩選出的有效靶點(diǎn),構(gòu)建重組慢病毒載體

3、Lenti-siR-miR-181,轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的原代成肌細(xì)胞(LV組),用抗螢光素酶的慢病毒載體(Lenti-siLUc)作為陰性對照(NC),以等體積的PBS設(shè)為對照組(CN)轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后1、3、5、7天分別提取全細(xì)胞蛋白、總RNA,Ploy(A)加尾qRT-PCR檢測miRNA-181水平,Western blot檢測Hox-A11蛋白,Real-Time PCR檢測病毒轉(zhuǎn)染后各時間點(diǎn)Hox-A11 mRNA水平。用CCK

4、-8檢測Lenti-siR-miR-181轉(zhuǎn)染后對成肌細(xì)胞增殖的影響,流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染后7天細(xì)胞周期分布。Real-Time PCR檢測Lenti-siR-miR-181轉(zhuǎn)染后7天成肌細(xì)胞Cx43 mRNA水平的變化,免疫熒光檢測成肌細(xì)胞Cx43蛋白的表達(dá)情況。冠狀動脈結(jié)扎制造大鼠心肌梗死模型(n=126),術(shù)后1周超聲檢測心功能,隨機(jī)分為3組,再次開胸向梗死心肌邊緣注射移植100μL(共5x106個細(xì)胞)細(xì)胞懸液(MI-SKMLV組

5、),用轉(zhuǎn)染Lenti-siLUc的成肌細(xì)胞作為陰性對照(MI-SKM),對照組僅注射100μLPBS(MI-PBS組)(每組有n=22),細(xì)胞移植后2周,超聲學(xué)檢測心功能,在體電生理檢查,程序性電刺激檢測各組室性心動過速的誘出率。ELASA檢測各組血清BNP水平,免疫組織化學(xué)檢測心肌內(nèi)移植細(xì)胞Hox-A11和Cx43的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：siR-1組Hox-A11蛋白水平明顯高于NC組(0.337821±0.021367 v

6、s.0.196605±0.020873,P<0.001)。重組慢病毒載體Lenti-sir-miR-181可以高效轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞(轉(zhuǎn)染效率最高為86.58％)。轉(zhuǎn)染后3、5、7天,LV組miRNA-181分別為CN組的63±5.7％.32±2.1％和30±2.9％,P<0.05；CN組在轉(zhuǎn)染后3、5、7天,HOXA114蛋白水平與轉(zhuǎn)染后1天相比明顯降低(d3:0.38019±0.01295vs0.7181±0.0532,P<0.001),

7、(d5:0.13675±0.007410 vs.7181±0.0532,P<0.001),(d7:0.0780±0.014430 vs.7181±0.0532,P<0.001)。LV組第5、7天明顯高于對照組((Day5:0.33774±0.029814 vs.0.157374±0.040879,P<0.001；Day7:0.308151±0.015803 vs.0.134021±0.043901,P<0.001).)而各時間點(diǎn)Hox-

8、All mRNA水平無明顯差異(P=0.071))。LV組在轉(zhuǎn)染后7天增殖明顯強(qiáng)于CN組,S期細(xì)胞比例明顯高于CN組,LV組轉(zhuǎn)染后7天CX43蛋白表達(dá)明顯高于CN組。細(xì)胞移植后2周MI-SKMLV組和MI-SKM組大鼠LVEF明顯高于對照組MI-PBS(MI-SKMLV vs.MI-PBS:43.05±3.16％ vs.33.67±1.99％.P<0.05；MI-SKM vs.MI-PBS:41.91±2.7％ vs.33.67±1.9

9、9％,P<0.05)。細(xì)胞移植組BNP水平明顯低于對照組(MI-SKM vs.MI-PBS:5954.056379±1679.094075ng/ml vs.11086.580±3094.352 ng/ml,P<0.05:MI-SKMLV vs.MI-PBS:5031.533±2420.049 ng/ml vs.11086.580±3094.352 ng/ml,P<0.05)。移植后MI-PBS組室性心動過速的誘出率為27.7％MI-SK

10、M組為70％(P<0.01 vs.MI-PBS)MI-SKMLV組35％(P<0.01 vs.MI-SKM and P>0.05 vs.MI-PBS)
　　 結(jié)論：針對miRNA-181前體莖環(huán)結(jié)構(gòu)的siRNA慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞可以有效地敲除miRNA-181的內(nèi)源性表達(dá)。成肌細(xì)胞miRNA-181敲除可以促進(jìn)體外培養(yǎng)的成肌細(xì)胞增殖,阻止成肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化時cx43的降低。敲除miRNA-181的成肌細(xì)胞和成肌細(xì)胞一樣可以