1、中藥是中華民族的瑰寶，其中的天然活性成分及代謝產(chǎn)物是新藥創(chuàng)制的重要來源。然而，天然活性成分結構中通常含有多個活性中心，往往作用于多個靶點，通過許多物理或功能上緊密相聯(lián)的分子或通路網(wǎng)絡而不是某個孤立蛋白發(fā)揮作用，具有多活性中心、多靶點協(xié)同作用發(fā)揮藥效的特點，不適于單靶點藥物藥效機制研究模式。因此，中藥活性成分多靶點協(xié)同作用的藥效機制研究已成為中藥現(xiàn)代化道路上的一個重大“瓶頸”。本研究采用新型靶標鑒定技術聯(lián)合多組學分析策略:第一:篩選出大鼠

2、灌胃黃芩水提液后含藥血清中的體內抗肝癌活性成分——千層紙素A，探究其抗腫瘤作用靶點及藥效機制;第二:鑒定中藥一類新藥丹參素鈉注射劑活性成分丹參素鈉的結合靶標蛋白，探究其心血管保護藥效機制。
　　1.全二維HepG2細胞膜色譜篩選大鼠灌胃黃芩水提液后含藥血清中的體內抗肝癌活性成分
　　細胞膜色譜(CMC)是一種表征藥物與膜受體間相互作用的生物親和色譜技術，廣泛用于中藥等復雜體系中活性成分的篩選。在本研究中，建立了一種在線全二維

3、HepG2細胞膜色譜/富集柱/高效液相色譜/飛行時間質譜模型，快速篩選大鼠灌胃黃芩水提液后含藥血清中的活性成分，并利用MATLAB軟件編寫的一個程序，有效地消除了血清中基質效應的干擾。從黃芩水提液中篩選到黃芩素、漢黃芩素、白楊素、千層紙素A、黃芩新素及半枝蓮種素6種活性成分，同時從黃芩水提液和含藥血清中篩選到漢黃芩素、千層紙素A及黃芩新素3種活性成分。細胞增殖實驗表明從體內含藥血清中篩選到漢黃芩素及千層紙素A能夠顯著抑制HepG2細胞的

4、增殖且呈現(xiàn)濃度依賴性，其IC50值分別為69.83及16.66μM，并且促進腫瘤細胞的調亡，可作為抗肝癌前體藥物。本研究首次鑒定出黃芩大鼠含藥血清中的體內抗肝癌活性成分漢黃芩素、千層紙素A及黃芩新素，所建立的HepG2細胞膜色譜模型及基質干擾消除策略在體內活性成分篩選中具有獨特的優(yōu)勢，同樣適用于其他生物樣品、生物色譜模型及中藥體內活性成分研究。
　　2.千層紙素A以轉酮醇酶為靶點通過抑制非氧化磷酸戊糖途徑和激活p53通路發(fā)揮抗肝癌

5、作用
　　在前一章研究基礎上，針對抗腫瘤活性最強的活性成分千層紙素A，進一步全面探究其體內外抗肝癌活性、作用靶點及潛在藥效機制。細胞增殖、凋亡和周期實驗結果表明，千層紙素A可顯著抑制HepG2細胞增殖、誘導凋亡并且使細胞分裂阻滯在G2/M期;裸鼠異種移植模型表明千層紙素A能夠抑制體內腫瘤生長。通過藥物親和反應靶標穩(wěn)定分析(DARTS)，發(fā)現(xiàn)千層紙素A特異性結合非氧化磷酸戊糖途徑關鍵酶(Nonoxidative PPP)——轉酮醇酶

6、(TKT)，KD值為11.2μM，其相互作用通過分子對接、酶活性測定、蛋白表達及TKT干擾后抗腫瘤效應變化進一步證實。此外，靶向代謝物相對定量分析表明千層紙素A抑制TKT催化活性導致核糖-5-磷酸(R5P，腫瘤細胞中核糖核苷酸合成的關鍵原料)產(chǎn)量下降，進而誘導腫瘤細胞凋亡。HepG2細胞轉錄組測序結果表明千層紙素A影響缺氧誘導因子。1(HIF-1)信號通路、鞘糖脂生物合成及氨基酸代謝等與非氧化磷酸戊糖途徑密切相關的通路，且p53凋亡途徑

7、被顯著激活，與TKT干擾后的HepG2細胞RT-PCR array分析結果一致。本研究表明，千層紙素A是一種新型TKT抑制劑，通過抑制非氧化磷酸戊糖途徑和激活p53信號通路發(fā)揮抗肝癌作用。千層紙素A可作為新型TKT或非氧化磷酸戊糖途徑抑制劑研發(fā)的前體藥物。
　　3.丹參素鈉通過線粒體途徑保護HUVEC細胞抗叔丁基過氧化氫誘導的氧化損傷
　　丹參素鈉是中藥丹參中主要水溶性活性成分丹參素的羧酸鹽，丹參素鈉注射劑已獲CFDA批準進

8、入臨床Ⅰ期試驗，用于冠心病及穩(wěn)定性心絞痛的治療。在本研究中，探討丹參素鈉保護人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)抗叔丁基過氧化氫(t-BHP)誘導的氧化損傷藥效機制。結果表明，丹參素鈉預給藥可顯著改善t-BHP氧化損傷誘導的HUVEC生長抑制和凋亡。基于超高效液相色譜/四極桿飛行時間質譜(UPLC-QTOF-MS)的細胞代謝組學分析表明，t-BHP氧化損傷主要上調了色氨酸代謝和苯丙氨酸代謝中的13個代謝產(chǎn)物，與線粒體功能和氧化應激密切相關，5

9、0μM丹參素鈉預給藥可顯著逆轉這些代謝變化。分子生物學實驗表明，丹參素鈉預處理可改善t-BHP氧化損傷誘導的乳酸脫氫酶(LDH)、細胞內活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)和線粒體膜電位(MMP)的升高，并可調節(jié)JAK2/STAT3和PI3K/Akt/GSK-3β及線粒體抗氧化途徑關鍵抗氧化酶的表達。結果表明，丹參素鈉可能通過線粒體抗氧化通路保護HUVEC抗t-BHP誘導的氧化損傷。
　　4.基于蛋白質組芯片及血清代謝組學分析的丹參

10、素鈉心梗保護藥效機制研究
　　丹參素在臨床上廣泛用于心血管疾病的治療，但是目前其直接結合靶標蛋白仍不清楚，心臟保護藥效機制仍需深入研究。本研究擬考察丹參素鈉(SAAS)注射劑對心梗大鼠心肌保護作用，探究其結合靶標蛋白及潛在藥效機制。通過左冠狀動脈前降支結扎術構建大鼠心肌梗死(MI)模型，探究SAAS對心梗大鼠保護作用。結果表明，SAAS能顯著提高MI大鼠心臟功能，降低血清中乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(C

11、K-MB)和心肌肌鈣蛋白Ⅰ(cTnⅠ)的含量，減輕心梗損傷。采用蛋白質組芯片技術，發(fā)現(xiàn)370個蛋白與SAAS特異性結合，這些蛋白顯著富集于代謝通路。通過超高效液相色譜/四極桿飛行時間質譜(UPLC-QTOF-MS)系統(tǒng)，對心梗大鼠血清進行代謝組學分析。從大鼠血清中共鑒定到26種潛在生物標志物，包括各種甘油磷脂(GPLs)和一系列脂肪酸。代謝通路富集分析發(fā)現(xiàn)，心梗大鼠磷脂分解代謝、鞘脂代謝和亞油酸代謝增加，色氨酸代謝減弱，甘油磷脂代謝和原

12、代膽汁酸生物合成受損，而SAAS可顯著逆轉這些代謝變化。因此，SAAS可能通過逆轉心梗損傷引起的多種代謝變化發(fā)揮心梗保護作用。本研究不僅有助于揭示SAAS的心血管保護藥效機制，為其臨床應用提供科學依據(jù);此外，由蛋白質組芯片鑒定到的與SAAS特異性結合的370種蛋白可作為其進一步發(fā)展的寶貴資源。
　　5.基于大鼠心肌蛋白質組學及轉錄組學分析的丹參素鈉心梗保護藥效機制研究
　　前期研究證實了丹參素鈉對左冠狀動脈前降支結扎誘導的大

13、鼠心肌梗死(MI)的保護作用，其潛在機制與逆轉MI損傷引起多種代謝變化有關。本研究通過對丹參素鈉(SAAS)治療的心肌梗死大鼠心肌組織進行蛋白質組學和轉錄組學分析，進一步探究丹參素鈉心血管保護藥效機制。結果表明，在假手術組、心梗模型組、SAAS治療組之間差異表達的基因和蛋白質是一些重要的轉錄因子、輔因子、結構分子和受體，主要參與細胞過程、生物過程中的細胞結合、細胞成分和分子功能等生命過程。功能富集分析表明，SAAS主要參與調控肌動蛋白細

14、胞骨架、吞噬、黏著、緊密連接、細胞凋亡、MAPK通路及Wnt信號通路等。SAAS可能通過轉錄、翻譯尤其是代謝調控等多層次生命活動發(fā)揮心臟保護作用。本研究不僅為心肌梗死發(fā)病機制提供了新的視角，而且從轉錄和翻譯水平闡釋了SAAS的心臟保護藥效機制，為其臨床應用提供科學依據(jù)。
　　綜上所述，本研究主要通過藥物親和反應靶標穩(wěn)定分析、蛋白質組芯片等新型靶標鑒定技術聯(lián)合轉錄組學、蛋白質組學及代謝組學等多組學分析，探究大鼠灌胃黃芩水提液后含藥血

15、清中的體內抗肝癌活性成分千層紙素A及心血管保護中藥一類新藥丹參素鈉的作用靶標蛋白及藥效機制。研究發(fā)現(xiàn)，千層紙素A以TKT為靶點，通過抑制非氧化磷酸戊糖途徑和激活p53信號通路干擾DNA合成發(fā)揮抗肝癌作用，千層紙素A可作為新型TKT抑制劑;丹參素鈉通過調控代謝及線粒體抗氧化通路保護HUVEC抗t-BHP誘導的氧化損傷，通過改善大鼠心梗損傷誘導的代謝變化及調控肌動蛋白細胞骨架、吞噬、黏著、緊密連接、細胞凋亡、MAPK通路和Wnt信號通路等，