1、目的：
　　腫瘤對全世界公共衛(wèi)生構(gòu)成了重大威脅，自1990年以來，大多數(shù)國家的腫瘤發(fā)病率有所上升。腫瘤是導(dǎo)致死亡的主要原因之一，它嚴(yán)重影響了發(fā)達國家和發(fā)展中國家人們的身體健康。手術(shù)、化療和放療等傳統(tǒng)的腫瘤治療方法仍然是大多數(shù)人選擇的腫瘤的主要治療方法。然而這些常規(guī)治療方法存在著全身毒性、低選擇性、耐藥性等缺點，因此，迫切需要具有選擇性高、微創(chuàng)并且副作用小的腫瘤治療的新方法。近些年來，隨著超聲技術(shù)的不斷創(chuàng)新和發(fā)展，低頻超聲作為一種安

2、全性高、副作用小的方法在腫瘤治療方面的應(yīng)用逐漸受到重視。研究證實在低頻超聲輻照下，其產(chǎn)生的空化效應(yīng)對腫瘤細(xì)胞造成損傷、促進腫瘤細(xì)胞凋亡，并且可以損傷腫瘤血管，使腫瘤區(qū)域的血流灌注明顯減少。同時有研究證明低頻超聲還可通過逆轉(zhuǎn)腫瘤介導(dǎo)的T細(xì)胞耐受來增強抗腫瘤免疫應(yīng)答。近年來，髓源抑制細(xì)胞(MDSCs)一直是眾多抗腫瘤免疫機制研究的焦點。MDSCs是處于不同分化階段的骨髓細(xì)胞的一群異質(zhì)細(xì)胞群，在腫瘤的發(fā)生和進展中發(fā)揮重要作用。MDSCs通過抑

3、制CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞等淋巴細(xì)胞的增殖和功能來抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)，它是腫瘤逃避免疫監(jiān)測和腫瘤進展的重要因素。研究證明化療藥物如吉西他濱(GEM)等以及多克隆抗體如抗Gr-1抗體等也可通過選擇性清除MDSCs來增強抗腫瘤免疫應(yīng)答從而達到抑制腫瘤生長的目的。但是，這些化療藥物不能靶向作用于腫瘤細(xì)胞或MDSCs，并同時損傷腫瘤周圍的正常組織及細(xì)胞，甚至可能導(dǎo)致骨髓抑制等嚴(yán)重毒副作用。而目前關(guān)于低頻超聲是否能夠通過抑制MDSCs的增殖和功能

4、來介導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答仍未見報道。本研究擬首先建立小鼠乳腺癌移植瘤模型，分別通過低頻超聲、抗Gr-1抗體及吉西他濱來對荷瘤小鼠進行處理，評價其腫瘤的生長情況、腫瘤新生血管生成的情況以及免疫細(xì)胞如CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞的增殖情況，同時檢測荷瘤小鼠腫瘤部位的MDSCs的數(shù)量，并且檢測低頻超聲是否能夠在體外和體內(nèi)同時誘導(dǎo)MDSCs凋亡，來探討MDSCs在低頻超聲治療腫瘤中的作用及其相關(guān)機制。
　　方法：
　　培養(yǎng)Balb/c小鼠來

5、源的小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞，并接種于小鼠左側(cè)第二對乳腺周圍區(qū)，建立小鼠乳腺癌移植瘤模型。然后將成瘤小鼠隨機分為四組:空白對照組(Control)、抗Gr-1抗體組（anti-Gr-1）、吉西他濱組(GEM)、低頻超聲組(LFU)，分別經(jīng)處理后，測量小鼠的體重和腫瘤的大小及質(zhì)量;免疫熒光及蛋白印跡實驗測定VEGFA、Flk-1、CD34和MMP-9的表達水平，觀察低頻超聲對腫瘤新生血管的影響;免疫熒光實驗檢測CD8和NKp46的表達水平，觀

6、察低頻超聲對荷瘤小鼠體內(nèi)的CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞數(shù)量的影響;免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)試驗分析Gr-1+CD11b+細(xì)胞的含量及MDSCs在體內(nèi)的凋亡情況。并分離提純MDSCs，隨機分為四組:空白對照組(Control)、抗Gr-1抗體組（anti-Gr-1）、吉西他濱組(GEM)、低頻超聲組(LFU)，分別經(jīng)處理后流式細(xì)胞儀檢測觀察低頻超聲對MDSCs凋亡率的影響，從而明確低頻超聲介導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答的部分機制。
　　結(jié)果：
　

7、　1.經(jīng)處理后，與空白對照組相比，抗Gr-1抗體組、吉西他濱組和低頻超聲組小鼠的腫瘤體積和質(zhì)量均減小，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。低頻超聲組小鼠的腫瘤體積和質(zhì)量與抗Gr-1抗體組相比顯著減小，而與吉西他濱組相比，腫瘤的體積和質(zhì)量變化沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。經(jīng)低頻超聲輻照、抗Gr-1抗體以及吉西他濱處理后，各組小鼠的體重有減輕趨勢，各組之間的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，但吉西他濱組小鼠體重與其他各組相比，減輕尤為顯

8、著。
　　2.與空白對照組相比，抗Gr-1抗體組、吉西他濱組和低頻超聲組的VEGFA、其受體Flk-1、CD34及MMP-9的表達量顯著減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。低頻超聲組與與抗Gr-1抗體組相比，VEGFA、Flk-1和CD34的表達水平明顯減少，而與吉西他濱組相比差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　3.與空白對照組相比，抗Gr-1抗體組、吉西他濱組、低頻超聲組的CD8和NKp46表達顯著增強（P＜

9、0.001），與抗Gr-1抗體組及吉西他濱組相比，低頻超聲治療顯著增加了CD8和NKp46的表達水平。
　　4.與空白對照組相比，抗Gr-1抗體組、吉西他濱組和低頻超聲組的腫瘤組織和骨髓細(xì)胞中Gr-1+CD11b+細(xì)胞的含量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。與抗Gr-1抗體組相比，低頻超聲顯著降低了MDSCs的含量。然而，MDSCs的數(shù)量在吉西他濱組和低頻超聲組之間沒有差異(P＞0.05)。
　　5.分離提純MDSCs，

10、經(jīng)處理后，與對照組相比，抗Gr-1抗體組、吉西他濱組和低頻超聲組中MDSCs的凋亡百分比顯著增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。低頻超聲組與抗Gr-1組相比，MDSCs的凋亡率明顯增加，然而與吉西他濱組相比差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　6.低頻超聲組腫瘤組織的Gr-1+細(xì)胞中caspase-3的表達量與對照組及抗Gr-1抗體組相比顯著增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)，而與吉西他濱組相比差異不具有統(tǒng)計學(xué)