1、目的:過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)可介導(dǎo)多種物質(zhì)代謝途徑和藥物治療效應(yīng)。本研究旨在通過(guò)PPARs基因載體質(zhì)粒與過(guò)氧化物酶體增殖物反應(yīng)元件(PPRE)報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,人工模擬PPARs信號(hào)通路,通過(guò)陽(yáng)性藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn),評(píng)價(jià)該細(xì)胞模型作為藥物篩選新平臺(tái)應(yīng)用的可行性,為進(jìn)一步篩選具有生物活性的PPARs配體激動(dòng)劑提供一種新的細(xì)胞模型篩選方法。
　　 方法:(1)細(xì)胞培養(yǎng)及質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染:用含10％胎牛血清的HG-DM

2、EM于37℃、5％CO2飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)293T細(xì)胞。取第3代細(xì)胞,按8×104個(gè)細(xì)胞/孔的細(xì)胞密度接種于24孔板中,待細(xì)胞生長(zhǎng)匯合度達(dá)90～95％時(shí),采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofectamine2000進(jìn)行質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分為phPPARα-IRES2-EGFP轉(zhuǎn)染組、phPPARγ-IRES2-EGFP轉(zhuǎn)染組和空載體pIRES2-EGFP轉(zhuǎn)染組(對(duì)照組),每組均共轉(zhuǎn)染含人PPRE報(bào)告質(zhì)粒ptk-PPRE×3-luc(含螢火蟲(chóng)熒光素酶

3、報(bào)告基因)、內(nèi)部對(duì)照質(zhì)粒pRL-CMV(含海腎熒光素酶報(bào)告基因)。(2)轉(zhuǎn)染效率檢測(cè):轉(zhuǎn)染36h后,采用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)情況,并用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)phPPARα-IRES2-EGFP和phPPARγ-IRES2-EGFP質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率。(3)特異性PPARs配體陽(yáng)性藥物干預(yù)293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染體系:轉(zhuǎn)染14h后,各轉(zhuǎn)染組分別加入1‰DMSO、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5

4、mol/L、10-4mol/L濃度梯度的陽(yáng)性藥物(phPPARα-IRES2-EGFP轉(zhuǎn)染組選用WY14643,phPPARγ-IRES2-EGFP轉(zhuǎn)染組選用羅格列酮),藥物作用24h后采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)法(DLR)檢測(cè)雙熒光素酶活性,獲得不同藥物濃度作用下的雙熒光素酶報(bào)告基因比值(F/R值),分析陽(yáng)性藥物作用的量-效關(guān)系;并用10-5mol/L濃度陽(yáng)性藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行時(shí)-效分析。(4)PPARs藥物篩選細(xì)胞平臺(tái)特異性鑒定:對(duì)上

5、述反應(yīng)體系交叉更換干預(yù)藥物,PPARα反應(yīng)體系采用羅格列酮,而PPARγ則用WY14643,用以檢測(cè)上述體系的特異性。實(shí)驗(yàn)還采用RXRα配體全反式維甲酸(ATRA)代替PPARs陽(yáng)性藥物,分別對(duì)上述反應(yīng)體系進(jìn)行干預(yù),以了解上述體系是否可通過(guò)全反式維甲酸激動(dòng)。(5)熒光定量PCR檢測(cè)陽(yáng)性藥物作用后各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞PPARs及RXRα基因mRNA表達(dá)水平。(6)PPARs藥物篩選細(xì)胞平臺(tái)應(yīng)用能力評(píng)價(jià):采用臨床使用的貝特類(lèi)降脂藥苯扎貝特、環(huán)丙貝特

6、、氯貝丁酯對(duì)建立的PPARα藥物篩選細(xì)胞平臺(tái)進(jìn)行應(yīng)用檢測(cè)。
　　 結(jié)果:(1)熒光顯微鏡下phPPARα-LRES2-EGFP和phPPARγ-IRES2-EGFP轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光;FCM分析結(jié)果顯示,2種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染效率分別達(dá)為68.30％和67.56％,熒光顯微鏡觀察GFP報(bào)告基因表達(dá)強(qiáng)。(2)陽(yáng)性藥物干預(yù)相應(yīng)293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染體系的F/R值均具有良好的量-效和時(shí)-效關(guān)系,DLR檢測(cè)量-效分析結(jié)果:2種人PPAR

7、s基因細(xì)胞轉(zhuǎn)染體系的PPRE報(bào)告質(zhì)粒熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)水平(F/R值)隨著相應(yīng)陽(yáng)性藥物濃度升高而升高,但藥物濃度過(guò)高又會(huì)抑制其表達(dá)F/P,值反而降低(P＜0.01),而空載體pIRES2-EGFP轉(zhuǎn)染組在不同藥物及濃度作用下的F/R值始終呈低值基線(xiàn)狀態(tài):時(shí)-效分析結(jié)果:2種人PPARs基因細(xì)胞轉(zhuǎn)染體系的PPRE報(bào)告質(zhì)粒熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)水平(F/R值)隨著相應(yīng)陽(yáng)性藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)而升高(P＜0.01)。(3)PPARα特異性配體W

8、Y14643不能激動(dòng)PPARγ轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞反應(yīng)體系,而羅格列酮?jiǎng)t可部分激動(dòng)PPARα轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞反應(yīng)體系,但其反應(yīng)強(qiáng)度不及WY14643(P＜0.05)。2種PPAR轉(zhuǎn)染細(xì)胞體系均不能被全反式維甲酸有效激活。(4)RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,不同陽(yáng)性藥物及濃度作用下的phPPARα-IRES2-EGFP轉(zhuǎn)染組293T細(xì)胞PPARαmRNA表達(dá)水平比空載體對(duì)照組高4個(gè)數(shù)量級(jí),phPPARγ-IRES2-EGFP轉(zhuǎn)染組293T細(xì)胞

9、PPARγmRNA表達(dá)水平比空載體對(duì)照組高2～3個(gè)數(shù)量級(jí),mRNA表達(dá)水平提示導(dǎo)入的重組質(zhì)粒能夠高效表達(dá)PPARs。而各組RXRotmRNA呈一致性的低水平表達(dá)。(5)貝特類(lèi)降脂藥苯扎貝特、環(huán)丙貝特、氯貝丁酯對(duì)建立的PPARα藥物篩選細(xì)胞平臺(tái)均呈現(xiàn)良好的量-效反應(yīng)性,但反應(yīng)強(qiáng)度因3種藥物濃度不同而存在差異(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:成功構(gòu)建了一種新的基于以人PPARs受體為靶標(biāo)的藥物篩選細(xì)胞平臺(tái),為進(jìn)一步研究PPARs功能和