1、目的：在法醫(yī)實(shí)際檢案中，經(jīng)常遇到當(dāng)事人在遭受持續(xù)捆綁或限制體位等束縛情形下出現(xiàn)意識(shí)障礙、精神異常、重要生命器官損傷甚至死亡。由于此類案件中損傷本身不足以導(dǎo)致上述嚴(yán)重后果，甚至沒(méi)有明顯的肉眼可見的外傷，因此，常常由于死亡原因不確定或有爭(zhēng)議，致使案件久拖不決，造成不良社會(huì)影響。分析此類案件的特點(diǎn)，當(dāng)事人均存在不同程度的心理應(yīng)激過(guò)程。研究證實(shí)，過(guò)度而持久的心理應(yīng)激可以引起精神異常，但具體機(jī)制尚不清楚，其已成為法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亟待解決的科學(xué)問(wèn)題。

2、r>　　應(yīng)激是指機(jī)體在受到一定強(qiáng)度的應(yīng)激原（軀體或心理應(yīng)激）作用時(shí)所出現(xiàn)的全身性的非特異性神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)。在正常情況下，適度應(yīng)激是一種機(jī)體自身的防御性反應(yīng)，但過(guò)強(qiáng)或持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的應(yīng)激可導(dǎo)致受害人多種器官功能障礙和代謝紊亂，其能力儲(chǔ)備及防御機(jī)能被逐漸消耗，內(nèi)環(huán)境嚴(yán)重失調(diào)、紊亂，直至出現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)器官衰竭乃至死亡。
　　HPA軸（下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸，hypothalamus-hypophysis-adrenal cortex

3、axis）興奮，糖皮質(zhì)激素（glucocorticoid，GC）分泌增多是應(yīng)激最主要的神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)之一。正常濃度的GC對(duì)于維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)和機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育有重要意義。當(dāng)應(yīng)激原持續(xù)存在，或應(yīng)激強(qiáng)度持續(xù)增強(qiáng)時(shí)，GC則會(huì)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成嚴(yán)重的損害。研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)度應(yīng)激時(shí)， HPA軸過(guò)度激活，高濃度GC可以引起海馬神經(jīng)元變性和損傷，提示GC對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的此類損傷很可能是心理應(yīng)激導(dǎo)致精神損傷的機(jī)制之一。
　　杏仁核(Amygdala

4、)是邊緣系統(tǒng)中最重要的核團(tuán)之一，它的纖維聯(lián)系和功能極其廣泛，是產(chǎn)生、識(shí)別、調(diào)節(jié)情緒，控制恐懼學(xué)習(xí)和記憶的神經(jīng)中樞，在情感記憶的形成和貯存方面起著至關(guān)重要的作用，對(duì)應(yīng)激反應(yīng)十分敏感。文獻(xiàn)報(bào)道杏仁核損傷在PTSD發(fā)病中發(fā)揮重要作用。因此研究GC對(duì)杏仁核的損傷作用對(duì)于揭示心理應(yīng)激引起精神損傷的機(jī)制具有重要科學(xué)意義。
　　本研究旨在細(xì)胞水平來(lái)探討GC對(duì)原代培養(yǎng)大鼠杏仁核神經(jīng)元凋亡的影響，為揭示應(yīng)激對(duì)杏仁核的損傷機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)，為應(yīng)激參與

5、的、涉及精神損傷的案件的鑒定提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1、本實(shí)驗(yàn)采用新生24h內(nèi)的Sprague Dawley（SD）乳鼠，75％乙醇全身消毒后，斷頭取腦，解剖顯微鏡下于冰上快速取出雙側(cè)杏仁核，制備成單細(xì)胞懸液，接種于多聚賴氨酸（PLL）包被的細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)。
　　2、待杏仁核原代神經(jīng)元發(fā)育成熟后，用免疫熒光標(biāo)記技術(shù)對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行MAP2神經(jīng)標(biāo)記物鑒定，并用免疫熒光標(biāo)記技術(shù)對(duì)原代培養(yǎng)杏仁核神經(jīng)元是否存在糖皮質(zhì)

6、激素受體（GR）進(jìn)行檢測(cè)。
　　3、為了明確GC能否導(dǎo)致原代培養(yǎng)杏仁核神經(jīng)元的凋亡，待神經(jīng)元發(fā)育成熟后，給予不同濃度的地塞米松（Dexamethasone）（10-9M-10-6M）作用48h，實(shí)驗(yàn)分為5組：Control、10-9M、10-8M、10-7M、10-6M，藥物作用后，采用流式細(xì)胞術(shù)Annexin-FITC/PI雙標(biāo)法檢測(cè)各組的凋亡率。
　　4、為了進(jìn)一步證實(shí)GC是否通過(guò)受體誘導(dǎo)杏仁核神經(jīng)元的凋亡，本實(shí)驗(yàn)采用G

7、C受體拮抗劑米非司酮（Mifepristone原代號(hào)RU486）與DEX（10-6M）共同孵育神經(jīng)元，實(shí)驗(yàn)分為四組：Control、DEX、DEX+MIF、MIF，作用48h后，采用TUNEL技術(shù)原位檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡的情況，用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)各組促凋亡基因BAX mRNA的表達(dá)情況。
　　5、數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）”表示，用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組均數(shù)的比較行單因素方差分析（ANO

8、VA），用最小顯著差法（least significant difference，LSD）作兩兩比較，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；
　　結(jié)果：
　　1、杏仁核神經(jīng)元原代培養(yǎng)結(jié)果：原代培養(yǎng)至8-10天時(shí)，神經(jīng)元胞體飽滿，呈圓形或橢圓形，立體感強(qiáng)，周圍有光暈，神經(jīng)元突起豐富，并相互交織形成網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)，此時(shí)神經(jīng)元已經(jīng)發(fā)育成熟，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。
　　本實(shí)驗(yàn)原代培養(yǎng)技術(shù)在傳統(tǒng)的神經(jīng)元原代培養(yǎng)方法上進(jìn)行了改進(jìn)。包括全程低溫操作

9、，多次離心去除雜質(zhì)，和實(shí)驗(yàn)器材方面的更新，使原代培養(yǎng)神經(jīng)元有更高的存活率，質(zhì)量更佳，而且神經(jīng)元培養(yǎng)環(huán)境得到了最大優(yōu)化，神經(jīng)元生長(zhǎng)較傳統(tǒng)方法快，神經(jīng)元突起的延展性表現(xiàn)更突出，更加便于鏡下觀察和后期處理。
　　2、經(jīng)神經(jīng)元特異性標(biāo)記物MAP2對(duì)原代培養(yǎng)的杏仁核神經(jīng)元進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示神經(jīng)元細(xì)胞純度大于90%，可以用于本實(shí)驗(yàn)研究。通過(guò)免疫熒光技術(shù)檢測(cè)杏仁核神經(jīng)元GC受體（GR），證實(shí)了原代培養(yǎng)杏仁核神經(jīng)元細(xì)胞膜上廣泛存在豐富的GR。

10、r>　　3、流式細(xì)胞術(shù)Annexin-FITC/PI雙標(biāo)法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡：與Control組相比，10-8M-10-6M的DEX作用于神經(jīng)元48h后，神經(jīng)元凋亡率明顯升高（P<0.05），且呈濃度依賴性，而10-9M組的凋亡率與Control組相比無(wú)顯著性差異（P>0.05），提示一定濃度的GC能夠?qū)е滦尤屎松窠?jīng)元凋亡。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取10-6M DEX。
　　4、TUNEL原位檢測(cè)凋亡：與對(duì)照組相比，DEX組陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)顯著升高；

11、而與DEX組相比，DEX+MIF組陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯降低（P<0.05）， MIF組與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（P>0.05）。證實(shí)GC通過(guò)受體發(fā)揮誘導(dǎo)杏仁核神經(jīng)元凋亡的作用。
　　5、Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)促凋亡基因BAX mRNA的表達(dá)：與對(duì)照組相比，DEX組BAX mRNA的表達(dá)量明顯升高（P<0.05）；而與DEX組相比，DEX+MIF組的BAX mRNA的表達(dá)量明顯降低（P<0.05），而MIF組與對(duì)照組相比無(wú)顯著