1、當(dāng)各種外源性與內(nèi)源性因子引起機(jī)體組織和細(xì)胞損傷性變化時(shí),機(jī)體的局部和全身也發(fā)生著一系列復(fù)雜的反應(yīng),以局限和消滅損傷因子,消除和吸收壞死組織,并修復(fù)損傷,這種復(fù)雜的以防御為主的反應(yīng)稱為炎癥反應(yīng)。因此任何疾病的發(fā)生都伴隨著炎癥反應(yīng),包括感染、創(chuàng)傷、失血等各種急性和慢性疾病。然而,當(dāng)炎癥反應(yīng)在初期未能得到及時(shí)有效的治療時(shí),隨后機(jī)體產(chǎn)生的多種炎性介質(zhì)即可形成“瀑布效應(yīng)”,使炎性反應(yīng)擴(kuò)大,甚至失去控制,導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征(Systemic I

2、nflammatory Response Syndrome,SRJS)的形成,進(jìn)而發(fā)展為多器官功能衰竭(Multiple Organ Dysfunction Syndrome,MODS),甚至死亡。因此,早期抑制炎癥反應(yīng),對(duì)于控制疾病的進(jìn)展,防止其進(jìn)一步惡化發(fā)揮著重要的作用。
　　 經(jīng)過(guò)幾十年的研究,當(dāng)炎癥反應(yīng)啟動(dòng)時(shí),機(jī)體發(fā)生的生理變化已經(jīng)明確,包括血管滲透性增高、血液流變學(xué)改變、白細(xì)胞與血小板黏附、紅細(xì)胞聚集、實(shí)質(zhì)細(xì)胞死亡等。

3、80年代,白細(xì)胞黏附和氧自由基的形成被認(rèn)為是炎癥反應(yīng)中重要的一部分。但是,實(shí)施清除氧自由基、抑制白細(xì)胞黏附等干預(yù)手段,對(duì)于抑制炎癥反應(yīng)的效果卻十分有限。于是科學(xué)家們不斷探索,究竟是什么機(jī)制觸發(fā)了炎癥反應(yīng),導(dǎo)致炎癥反應(yīng)在短時(shí)間內(nèi)迅速發(fā)展為SRIS和MODS呢?
　　 腸道的作用在多器官功能衰竭的發(fā)病機(jī)制中一直占有重要位置。1986年Meckins和Marshall首先提出腸道是發(fā)生MODS的原動(dòng)力。90年代,Chang TW研究也

4、證明腸道組織在失血性休克中的重要作用。在實(shí)驗(yàn)前切除大鼠全部小腸和部分大腸組織,可明顯提高休克復(fù)蘇后大鼠的存活率。但是,Chang TW并沒(méi)有闡述在休克發(fā)生時(shí),切除腸道組織在減輕機(jī)體損害方面的作用機(jī)制。近年來(lái)的研究進(jìn)一步表明,腸道作為體內(nèi)最大的“儲(chǔ)菌庫(kù)”和“內(nèi)毒素庫(kù)”,憑借其在體內(nèi)獨(dú)特的生理環(huán)境,參與了SIRS和MODS的病理生理過(guò)程。很多學(xué)者提出了腸道細(xì)菌/內(nèi)毒素易位學(xué)說(shuō),認(rèn)為在創(chuàng)傷、休克、應(yīng)激等情況下,由于腸道缺血、腸上皮細(xì)胞損害,導(dǎo)

5、致腸黏膜屏障功能受損,腸道內(nèi)細(xì)菌和內(nèi)毒素易位,為炎性反應(yīng)提供了豐富的刺激物質(zhì),導(dǎo)致炎性反應(yīng)的持續(xù)發(fā)展進(jìn)而引起SIRS及MODS。但是,隨著研究的深入,越來(lái)越多的研究結(jié)果與腸道細(xì)菌/內(nèi)毒素易位學(xué)說(shuō)相矛盾。Koh研究顯示,僅在動(dòng)物淋巴結(jié)及輸入淋巴管中培養(yǎng)出細(xì)菌,而在輸出淋巴管中未能培養(yǎng)出細(xì)菌。臨床試驗(yàn)也證明,選擇性腸道去污或抗內(nèi)毒素治療法不能有效提高生存率。那么是否還存在其他機(jī)制,引發(fā)了休克發(fā)生時(shí)所伴隨的高水平的炎癥反應(yīng)呢?
　　

6、近些年,美國(guó)Geert W.Schmid—Sch6nbein的研究認(rèn)為,腸道內(nèi)的蛋白酶引起腸壁組織的分解,產(chǎn)生活性因子,是創(chuàng)傷、休克等重癥時(shí)引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合癥,進(jìn)而發(fā)展為多器官功能衰竭,甚至死亡的關(guān)鍵因素,即“自身消化”理論。當(dāng)機(jī)體受到各種損害因子侵犯時(shí),腸道黏膜受損,屏障作用減弱,胰腺消化酶進(jìn)入黏膜下層,甚至肌層,引起腸壁組織的自身消化。由此產(chǎn)生各種活性因子,激活炎癥細(xì)胞,釋放炎癥介質(zhì),引起機(jī)體一系列炎性反應(yīng)。這些活性因子和炎癥介

7、質(zhì)可通過(guò)腸壁淋巴循環(huán)和門靜脈循環(huán)進(jìn)入全身循環(huán)系統(tǒng),也可直接滲透進(jìn)入腹腔,引起遠(yuǎn)隔組織和器官的損害。
　　 研究顯示,在腸道缺血再灌注大鼠模型中,提前通過(guò)腸道內(nèi)灌注絲氨酸蛋白酶抑制劑加貝酯或耐莫司他的實(shí)驗(yàn)組大鼠,再灌注后大鼠的存活率明顯提高；檢測(cè)血漿活性水平,與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組大鼠血漿活性水平也明顯減低,炎癥反應(yīng)減弱。
　　 失血性休克發(fā)生時(shí),也伴隨著高水平的炎癥反應(yīng),若不能及時(shí)抑制,可最終引起多器官功能衰竭,導(dǎo)致死亡。

8、烏司他丁是臨床上常用的蛋白酶抑制劑,通過(guò)靜脈使用,其在治療急性胰腺炎、抗休克治療、體外循環(huán)心臟手術(shù)等方面的治療效果已經(jīng)得到肯定。但是,尚沒(méi)有關(guān)于腸道內(nèi)使用烏司他丁的相關(guān)研究報(bào)道。因此,本實(shí)驗(yàn)在建立失血性休克大鼠模型的基礎(chǔ)上,通過(guò)腸道內(nèi)給予蛋白酶抑制劑烏司他丁,探討是否能夠抑制腸道內(nèi)蛋白酶的自身消化作用,抑制炎癥反應(yīng),對(duì)失血性休克起到一定治療作用。為失血性休克的治療提供新的思路與方法。
　　 材料與方法
　　 1、動(dòng)物及分

9、組
　　 28只健康清潔級(jí)wistar大鼠,雌雄不限,體重220-270g。隨機(jī)分成四組:未灌注腸道組、鹽水灌注腸道組、烏司他丁灌注腸道組和烏司他丁靜脈組(見(jiàn)表1),每組7只。術(shù)前二十四小時(shí)正常飲食、飲水。
　　 2、失血性休克模型的制備
　　 健康wistar大鼠,以3％戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉。麻醉成功后,稱取大鼠體重。將大鼠仰臥位固定于實(shí)驗(yàn)手術(shù)板上,各皮、消毒,進(jìn)行右側(cè)股動(dòng)脈、股靜脈游離術(shù)。游

10、離好動(dòng)、靜脈后,以24號(hào)套管針?lè)謩e行股動(dòng)脈、股靜脈置管,以絲線結(jié)扎固定。插管后,立即注入0.3ml肝素生理鹽水(含肝素300U)。股動(dòng)脈套管經(jīng)三通閥與動(dòng)脈套裝相連,然后連接于血壓監(jiān)護(hù)儀,監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈壓變化。股靜脈套管與三通閥和2ml注射器相連,用于靜脈給藥。置管術(shù)完成后,于上腹部正中備皮、消毒,打開(kāi)腹腔。分別于十二指腸上端、回腸末端插入軟管,以絲線結(jié)扎固定,用于腸道灌洗。
　　 以上操作完成后,除未灌注腸道組,其余三組分別將50

11、ml37℃生理鹽水通過(guò)輸液泵經(jīng)十二指腸上端管道恒壓恒速灌入腸道,最后經(jīng)回腸末端將腸內(nèi)容物沖出。灌洗結(jié)束后,各組大鼠均經(jīng)股動(dòng)脈放血(30min內(nèi)完成)至平均動(dòng)脈壓40±5 mm Hg,并間斷回輸或放血維持此血壓。休克模型制作成功后,烏司他丁灌注腸道組腸道內(nèi)給予烏司他丁(50000U/Kg)鹽溶液10ml,靜脈給予生理鹽水0.5ml；烏司他丁靜脈組靜脈給予烏司他丁(50000U/Kg)鹽溶液0.5ml,腸道給予生理鹽水10ml；鹽水灌注腸道

12、組分別通過(guò)腸道和靜脈給予生理鹽水10ml、0.5ml；未灌注腸道組僅靜脈給予生理鹽水0.5ml。
　　 3、檢測(cè)指標(biāo)
　　 3.1休克前后平均動(dòng)脈壓變化
　　 通過(guò)心電監(jiān)護(hù)儀觀察并記錄大鼠休克前后平均動(dòng)脈壓的變化。記錄時(shí)間點(diǎn)分別為:插管后、灌注開(kāi)始、灌注10min、灌注結(jié)束、休克、休克30min、60min、90min、120min和180min,共10個(gè)時(shí)間點(diǎn)。
　　 3.2生存時(shí)間
　　 通過(guò)

13、觀察平均動(dòng)脈壓的變化,記錄從休克模型制作成功后到大鼠死亡的時(shí)間。當(dāng)大鼠心臟停止跳動(dòng),未經(jīng)處理5min沒(méi)有變化,確定為死亡。
　　 3.3血漿活性因子誘導(dǎo)人中性粒細(xì)胞黏附分子CD11b的表達(dá)
　　 將休克后大鼠血漿與健康人全血混合培養(yǎng),血漿中的活性因子可激活人中性粒細(xì)胞,促使細(xì)胞表面CD11b的表達(dá)增加。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)中性粒細(xì)胞表面CD11b的表達(dá)變化。
　　 在休克前、休克120min和180min分別取動(dòng)脈

14、血0.5ml,含肝素10u/ml。其中20μ1用于白細(xì)胞計(jì)數(shù),剩余全血離心500g,5min,取上層血漿-80℃保存?zhèn)錂z。
　　 取健康志愿者全血25ml,將50μl老鼠血漿與200μl健康志愿者全血混合,再加入DMEM培養(yǎng)基200μl,混勻后放入37℃培養(yǎng)箱孵育4小時(shí)。孵育結(jié)束后,取出加入FITC標(biāo)記的抗人中性粒細(xì)胞CD11b單克隆抗體,輕輕震蕩混勻后于黑暗處置于冰上45min。用紅細(xì)胞裂解機(jī)裂解紅細(xì)胞,PBS緩沖液洗滌白細(xì)胞

15、三次,最后將標(biāo)本放入流式細(xì)胞儀中,檢測(cè)CD11b的表達(dá)。FITC結(jié)合的同種人的IgGl抗體作為非特異性抗體結(jié)合的同種對(duì)照,數(shù)據(jù)用百分?jǐn)?shù)表示。
　　 3.4白細(xì)胞計(jì)數(shù)
　　 采用手工計(jì)數(shù)法計(jì)量休克前、休克120min和180min時(shí)外周血白細(xì)胞數(shù)目。將冰醋酸2ml加入到98ml蒸餾水中,再加入10g/L亞甲藍(lán)溶液3滴,混勻過(guò)濾后制成白細(xì)胞稀釋液。取稀釋液0.38ml于試管中,加入大鼠全血標(biāo)本20μl混勻。滴少量于血球計(jì)數(shù)板

16、上,充池、靜置2-3min后在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)。
　　 3.5腸道黏膜病理變化
　　 老鼠死亡后,在距屈氏韌帶5cm處取空腸組織約4cm,用0.9％生理鹽水反復(fù)沖洗4次,取中間2cm組織4％甲醛固定。經(jīng)脫水、浸蠟、包埋、切片、染色后制成病理切片,在光學(xué)顯微鏡下觀察比較不同處理組大鼠腸道黏膜的病理變化。
　　 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理,計(jì)量資料以(x)±s表示。采用重復(fù)測(cè)量

17、數(shù)據(jù)的方差分析和完全隨機(jī)設(shè)計(jì)多樣本比較的方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果
　　 1、休克前后平均動(dòng)脈壓變化
　　 采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析,比較休克前四個(gè)菌點(diǎn)組問(wèn)、組內(nèi)差異。結(jié)果顯示:不同處理組的組間效應(yīng),F=0.904(P=0.454,>0.05),說(shuō)明不同處理組休克前血壓變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)比較,F=1.174(P=0.322,>0.05),說(shuō)明休克前不同時(shí)間點(diǎn)血壓變化無(wú)統(tǒng)

18、計(jì)學(xué)差異。
　　 比較休克后各組大鼠組間差異,F=5.814(.P=0.006,<0.05),說(shuō)明經(jīng)不同處理后,休克后大鼠血壓變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。烏司他丁灌注腸道組與鹽水灌注腸道組比較,血壓明顯升高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.004,<0.05):烏司他丁靜脈組與鹽水組比較,血壓也升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.049,<0.05)。但烏司他丁腸道組和靜脈組比較(P=0.224,>0.05),鹽水灌注腸道組和未灌注腸道組比較(P=0.5

19、44,>0.05),差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2、生存時(shí)間比較
　　 采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)多樣本比較的方差分析,比較不同處理組大鼠生存時(shí)間。結(jié)果顯示:烏司他丁灌注腸道組與未灌注腸道組比較,生存時(shí)間延長(zhǎng),有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.008,<0.05):與鹽水灌注組比較,生存時(shí)間延長(zhǎng),有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.013,<0.05)；與烏司他丁靜脈組比較,生存時(shí)間也延長(zhǎng),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.039,<0.05)。但是,烏司他丁靜脈組

20、與鹽水灌注組、未灌注組比較,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　 3、血漿活性因子誘導(dǎo)人中性粒細(xì)胞黏附分子CD11b的表達(dá)
　　 (1)比較休克前各組大鼠血漿激活人中性粒細(xì)胞CD11b的表達(dá),F=0.147(P=0.930,>0.05),說(shuō)明休克前各組大鼠血漿活性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 (2)比較休克120min時(shí)各組大鼠血漿激活人中性粒細(xì)胞CD11b的表達(dá):烏司他丁灌注腸道組與未灌注腸道組比較,CD11b的表達(dá)降

21、低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.001,<0.05)；與鹽水灌注組比較,CD11b的表達(dá)降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.004,<0.05)；與烏司他丁靜脈組比較,表達(dá)也降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.004,<0.05)。烏司他丁靜脈組與鹽水組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.000,>0.05)。
　　 (3)比較休克180min時(shí)各組大鼠血漿激活人中性粒細(xì)胞CD11b的表達(dá):烏司他丁灌注腸道組與未灌注腸道組比較,CD11b的表達(dá)降低

22、,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.040,<0.05)；與鹽水灌注組比較,CD11b的表達(dá)降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.048,<0.05)；與烏司他丁靜脈組比較,表達(dá)也降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.033,<0.05)。烏司他丁靜脈組與鹽水組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.962,>0.05)。
　　 4、外周血白細(xì)胞數(shù)目
　　 (1)比較休克前各處理組大鼠外周血白細(xì)胞數(shù)目:F=0.508(P=0.681,>0.05),說(shuō)明休

23、克前各組大鼠外周血白細(xì)胞數(shù)目無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 (2)比較休克120min時(shí)各處理組大鼠外周血白細(xì)胞數(shù)目:烏司他丁灌注腸道組與未灌注腸道組比較,白細(xì)胞數(shù)目升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)；與鹽水灌注腸道組比較,白細(xì)胞數(shù)目升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)；與烏司他丁靜脈組比較,白細(xì)胞數(shù)目也升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)。烏司他丁靜脈組與鹽水灌注組比較,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.767,>0.05)。
　　

24、 (3)比較休克180min時(shí)各處理組大鼠外周血白細(xì)胞數(shù)目:烏司他丁灌注腸道組與未灌注腸道組比較,白細(xì)胞數(shù)日升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)；與鹽水灌注腸道組比較,白細(xì)胞數(shù)目升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.001,<0.05)；與烏司他丁靜脈組比較,白細(xì)胞數(shù)目也升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.001,<0.05)。烏司他丁靜脈組與鹽水組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.787,>0.05)。
　　 5、腸道黏膜病理變化
　

25、　 未灌注腸道組大鼠小腸黏膜固有層充血明顯,伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。腸絨毛數(shù)量減少,部分變短變粗,形態(tài)不規(guī)則,甚至出現(xiàn)絨毛斷裂現(xiàn)象,腸腔內(nèi)可見(jiàn)大小不等的絨毛碎片。上皮細(xì)胞排列紊亂,形態(tài)大小不一,可見(jiàn)細(xì)胞變性、壞死等。鹽水灌注腸道組和烏司他丁靜脈組腸道黏膜損害程度較未灌注腸道組略有減輕。烏司他丁灌注腸道組損害程度最輕。
　　 結(jié)論:
　　 1、腸道內(nèi)灌注烏司他丁可以延緩失血性休克大鼠休克后血壓下降過(guò)程,最終延長(zhǎng)存活時(shí)間。<