1、目的：⑴建立一種高效液相色譜(HPLC)-程序波長紫外檢測法同時測定血漿中色氨酸(tryptophan,Trp)及其主要代謝產(chǎn)物犬尿氨酸(kynurenine,Kyn)和5-五羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)的濃度。⑵考察促凝劑、抗凝劑以及分離膠對Trp,Kyn和5-HT測定的干擾情況,并選擇合適的抗凝劑。⑶用所建立的方法測定慢性乙肝患者(CHB)、抑郁癥患者和維持血液透析(HD)的尿毒癥患者HD前后及其各自的

2、正常對照血漿中Trp,Kyn和5-HT的濃度,從而了解患者血漿中Trp的代謝狀態(tài)以及HD對尿毒癥患者的治療效果。
　　 方法：①以茶堿為內(nèi)標,采用BDS-Hypersil-C8(150 mm×4.6 mm,5μm)柱分離。流動相為醋酸鈉緩沖液(10 mmol/L,pH4.5):乙腈94:6(v/v);流速為0.6 mL/min;柱溫為25℃;紫外檢測波長設(shè)定為0～5.5 min,360mm,5.6～6.0 min,220 nm,

3、6.1～7.0 min,302 nnl,7.1～8.0,360 nm。進樣量25μl,檢測時間8.0 min。②分別采用促凝管,肝素、乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)和加有分離膠的EDTA抗凝管收集全血樣本,分離血清或血漿,用HPLC-程序波長紫外檢測法測定并比較Trp,Kyn和5-HT的濃度。③用含EDTA的抗凝管分別收集15例抑郁癥患者、20例維持HD的尿毒癥患者、110例CH

4、B患者以及相應(yīng)的正常對照標本,1 h內(nèi)分離血漿,測定血漿中Trp、Kyn和5-HT的濃度。
　　 結(jié)果：⑴Kyn、5-HT、Trp和茶堿的保留時間分別為5.12、5.81、6.63和7.52 min。Kyn、5-HT和Trp的線性范圍分別為:0.421μmol/L～20.2μmol/L,4.36 nmol/L～980.5 nmol/L及3.97μmol/L～400.0μmol/L,最低檢測限分別為0.016μmol/L,2.03

5、 nmol/L和0.134μmol/L。三種分析物的日內(nèi)變異系數(shù)均小于4％,日間變異系數(shù)均小于5%,平均回收率在87%～113%之間。⑵采用肝素和加有分離膠的EDTA抗凝管的血漿標本其Trp,Kyn及5-HT含量的測定結(jié)果與EDTA抗凝管的血漿標本相比無顯著差異。對于Trp,Kyn的測定,采用促凝管的血清標本與其他三種抗凝管的血漿標本均無顯著差異,但血清的5-HT濃度顯著高于血漿(p＜0.01)。⑶抑郁癥患者Kyn、5-HT、Trp的血

6、漿水平均低于正常對照,且兩者之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)尿毒癥患者HD前血漿中Kyn,5-HT水平及Kyn/Trp比值均顯著高于正常對照(p＜0.01),而Trp濃度顯著低于正常對照(p＜0.01)。尿毒癥患者HD后Kyn,5-HT及Kyn/Trp比值均有所降低,但5-HT水平及Kyn/Trp比值仍較正常人高,Trp水平仍低于正常人乙肝患者Trp和5-HT水平均顯著低于正常對照(p＜0.01),Kyn/Trp則明顯高于對照組

7、(p＜0.01)乙肝患者HBV病毒復(fù)制數(shù)的對數(shù)(LogDNA)與Kyn(r=0.547;p=0.000)和Kyn/Trp(r=0.804;p=0.ooo)成明顯的正相關(guān),而與5-HT(r=-0.485;p=0.000)和Trp(r=-0.644;p=0.000)成明顯負相關(guān)。ALT與Kyn(r=0.265;p=0.000)和Kyn/Trp(r=0.224;p=0.020)均有相關(guān)性據(jù)病毒載量將CHB患者分成高(LogDNA＞6.0)、中

8、(LogDNA6.0～4.0),低(LogDNA＜4.0)病毒組。對于Trp和Kyn/Trp,各組之間均具有顯著差異(p＜0.01)。對于5-HT和Kyn,低病毒組和高、中病毒組之間有顯著差異(p＜0.01),高、中病毒組間也有明顯差異(p＜0.05)以酶活性為80 IU/L為界將患者分為高,低ALT酶活性組,結(jié)果顯示:高、低ALT酶活性組間Kyn和Kyn/Trp存在顯著差異。
　　 結(jié)論：①建立了一種HPLC-程序波長紫外檢測