1、隨著畜牧業(yè)快速迅猛的發(fā)展，畜禽養(yǎng)殖業(yè)的糞污已成為我國環(huán)境污染的主要來源之一。豬雞等單胃動物不能分泌植酸酶，使大量的磷從動物的糞中排出體外，對環(huán)境造成了很大的影響。所以，提高飼料中植酸磷的利用率，對保護環(huán)境和磷資源的節(jié)約利用有非常重大的意義。植酸酶是一種水解酶，可以將植酸分解成肌醇和磷酸而被動物消化吸收。因此，可通過植酸酶的作用增加日糧中植酸磷的利用率來減少糞中磷的排放，從而減輕磷對環(huán)境的污染。隨著基因工程技術(shù)的快速發(fā)展，尤其是轉(zhuǎn)基因動物

2、生產(chǎn)技術(shù)水平的逐漸提高，為這些問題的解決提供了一條新途徑。通過豬和禽等單胃動物自身消化道產(chǎn)生具有較高生物活性的內(nèi)源性植酸酶，已經(jīng)成為解決單胃動物高磷糞便污染的一種研究策略和手段。
　　本課題成功地將編碼對胃蛋白酶和胰蛋白酶具有穩(wěn)定性，對底物有較高親和力的植酸酶的基因與豬腮腺特異性表達的分泌蛋白調(diào)控序列（PSP啟動子）進行整合，構(gòu)建豬腮腺特異性表達的轉(zhuǎn)基因載體p-PSP-Intron-Cafp和PSP-Cafp-IRES-EGFP。

3、PSP-Cafp-IRES-EGFP轉(zhuǎn)基因載體在小鼠腮腺細胞中成功組織特異性表達。
　　本課題建立并優(yōu)化了胚胎成熟培養(yǎng)體系。在成熟培養(yǎng)體系中，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)22-24h時，卵母細胞的成熟液不添加FBS的成熟效果優(yōu)于添加FBS的成熟效果。在培養(yǎng)體系中，pzm-3培養(yǎng)液比NCSU培養(yǎng)液更適于胚胎培養(yǎng)。當(dāng)使用NCSU培養(yǎng)液時，在培養(yǎng)的第4天添加10％FBS可以顯著提升囊胚率。在孤雌激活試驗中，激活參數(shù)為120V，30μs，3脈沖的效果最好。<

4、br>　　本研究通過電轉(zhuǎn)染細胞的方法，將p-PSP-Intron-Cafp載體轉(zhuǎn)染大白豬(DB)和長白豬(LW)的成纖維細胞，成功獲得了轉(zhuǎn)植酸酶Cafp基因的DB和LW兩組轉(zhuǎn)基因陽性細胞系。以這些陽性細胞系為手工克隆的供體細胞，通過手工克隆技術(shù)在體外生產(chǎn)了轉(zhuǎn)基因囊胚810枚，將其中質(zhì)量較好的712枚囊胚移植到6頭受體母豬體內(nèi)，成功受孕4頭。3頭受孕豬成功分娩活仔豬14頭，斷奶存活仔豬6頭。PCR結(jié)果顯示，4頭斷奶前死亡的仔豬和3頭存活的

5、仔豬攜帶植酸酶Cafp基因。FISH實驗發(fā)現(xiàn)斷奶的6頭仔豬有5頭為轉(zhuǎn)基因陽性個體。PAGE實驗結(jié)果顯示，斷奶成活的6頭轉(zhuǎn)基因豬唾液均有陽性蛋白帶，但質(zhì)譜測定卻沒有檢測到植酸酶基因Cafp的表達。實驗豬6月齡時進行磷的表觀消化率測定，結(jié)果顯示對照組磷的表觀消化率平均為47.2％，轉(zhuǎn)植酸酶基因陰性豬組平均為44.7％，轉(zhuǎn)植酸酶基因陽性豬組平均為57.17％。轉(zhuǎn)植酸酶基因陽性豬磷的排放量平均比對照組降低了10百分點，差異顯著(P＜0.05)。