1、ZhejiangAgriculture&ForestryUniversityMasterDegreeThesisCloningandExpressionAnalysisofDoNIGenesinDendrobiumofficinaleCandiadate：CAOXiaofeiAdviser：DUANChengii，AssociateProfessorSpeciality：ForestryDateofSubmission：October1

2、2，2015ZhejiangA&FUniversityLinanzh一。PRChinainanzhejiangprovincehlna，rOctober，2015摘要摘要鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimumetMigo)屬蘭科(Orehidoideae)石斛屬(Dentrobium)多年生草本植物，為我國(guó)傳統(tǒng)名貴藥材。多糖是其主要活性成分，與鐵皮石斛的增強(qiáng)機(jī)體免疫機(jī)能、抗腫瘤、抗衰老、抗疲勞、降血糖等多種藥理作用

3、密切相關(guān)，也是目前評(píng)判鐵皮石斛品質(zhì)的主要指標(biāo)。多糖的合成以蔗糖為前體物質(zhì)，因此與蔗糖代謝密切相關(guān)。中性／堿性轉(zhuǎn)化酶(NI)將蔗糖不可逆地降解為葡萄糖和果糖，以滿足植物代謝中對(duì)己糖的需要，在植物蔗糖代謝與調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。本研究通過同源克隆、RTPCR和RACE技術(shù)，對(duì)鐵皮石斛中性／堿性轉(zhuǎn)化酶基因進(jìn)行克隆，分析其在鐵皮石斛中的時(shí)空表達(dá)，同時(shí)研究低溫、pH及外源添加物等對(duì)其基因表達(dá)的影響，構(gòu)建該基因的遺傳轉(zhuǎn)化載體并進(jìn)行異源轉(zhuǎn)化，初步揭示

4、NI在鐵皮石斛中的功能、表達(dá)及影響其表達(dá)的因素，為石斛多糖的代謝調(diào)控及鐵皮石斛的品質(zhì)育種提供理論依據(jù)。本文取得的主要結(jié)果如下：(1)利用GenBank油棕M基因序列，采用RTPCR和RACE的方法首次從鐵皮石斛中克隆得到中性／堿性轉(zhuǎn)化酶基因的全長(zhǎng)cDNA序列，并命名為DoNI(GenBank登錄號(hào)KP742351)，序列長(zhǎng)度為223lbp，開放閱讀框長(zhǎng)1665bp，編碼554個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量為628kD，等電點(diǎn)為656，具有中性／堿

5、性轉(zhuǎn)化酶保守結(jié)構(gòu)域，其編碼的氨基酸序列與的禾本科植物小米和短花藥野生稻的親緣關(guān)系最近，與單子葉其他植物油棕、海棗及小果野蕉也有較近的親緣關(guān)系，屬于同一進(jìn)化分支。(2)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究鐵皮石斛DoNI基因的時(shí)空表達(dá)，結(jié)果顯示：其在鐵皮石斛的根、莖、葉中均有表達(dá)，但在莖中的表達(dá)量最高；DoNI基因在組培苗與地栽植株不同生長(zhǎng)階段的表達(dá)也有差異，且變化趨勢(shì)一致，表達(dá)量從高到低的排序是12月份4月份8月份，與多糖含量的變化趨勢(shì)完全一致。