1、：llllIIIlllIIIIIIU卜一。Y331l0076j索取號(hào)：』掣上笪』且_壘旦攀』t。密級(jí)：’———蘭過L二二’‘3’0一‘南京師勉犬掌～_，一。碩士學(xué)位論文j固‘，|’凼鐵皮石斛qPCR內(nèi)參基因的篩選及開1=‘j花相關(guān)基因的表達(dá)分析一。j，t，：，：‘，。0研i究生：。。抽。。二一登趁：一，t’’、二j，“。j學(xué)4零’尊，癰：毒愛塞蕁哮譬蠖?！啊?。jj_∥一、。，二培養(yǎng)。。甍位：：!幽箋皇晦!≥、零慧≥鬟蕊。一警。0≥!受籬

2、童學(xué)!；辮毒凈鹺垂，、’≮、7i”一～，，，，：’；ri，√∥∥：”√j。u‘70、，?！埃?密成靜閭r與：墅!蘭笙幽塵旦：：：≮歹’。，、：，。礦笞‘。辯4時(shí)：向：‘ro。i至Q羔2』簟量縣至壘魚Ij，i7≯t≮謄：。i凈；Z’jj。j二?！收F皮石斛(DendrobiumofficinaleKimuraetMigo)隸屬蘭科(Orchidaceae)石斛屬(DendrobiumSw)，為中國(guó)傳統(tǒng)藥用植物。因其富含多糖、生物

3、堿、菲類化合物等多種藥用成分，擁有生津益胃、潤(rùn)肺止咳、增強(qiáng)免疫力等功效。對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行功能研究有助于更好地開發(fā)利用鐵皮石斛，基因的表達(dá)分析則是基因功能研究的一個(gè)重要方面。目前，基因表達(dá)量一般通過熒光定量PCR相對(duì)定量的方法進(jìn)行分析，而穩(wěn)定的內(nèi)參基因是qPCR相對(duì)定量準(zhǔn)確的保障。為了研究鐵皮石斛不同組織中、不同生長(zhǎng)階段中及非生物脅迫條件下的功能基因表達(dá)，篩選特定試驗(yàn)條件下的最佳內(nèi)參基因或基因組合是十分必要的。本研究選取了7個(gè)常用的內(nèi)參基因

4、(Act／n、18SrRNA、GAPDH、EFla、TUA、TUB、UBQ)作為候選基因，通過qPCR絕對(duì)定量方法分別比較了鐵皮石斛不同組織中(原球莖、根、莖、葉、花、種子)、不同生長(zhǎng)階段以及非生物脅迫條件下(高溫、低溫和干旱)各候選內(nèi)參基因的表達(dá)差異。隨即對(duì)獲得的數(shù)據(jù)采用三個(gè)內(nèi)參基因穩(wěn)定性評(píng)估軟件geNorm、NormFinder和BestKeeper進(jìn)行分析，最終篩選到特定試驗(yàn)條件下最合適的內(nèi)參基因和內(nèi)參基因數(shù)。在鐵皮石斛不同組織中

5、，geNorm與NormFinder軟件分析結(jié)果較為一致，而Bestkeeper軟件分析的結(jié)果與以上兩種軟件的分析結(jié)果存在差異。geNorm和NormFinder軟件分析得出候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性最低者為18SrRNA，最高者為GAPDH。Bestkeeper軟件分析得出候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性最低者為TUA，最高者為18SrRNA。此外，依據(jù)geNorm軟件的配對(duì)差異值Vn／n1，確定該試驗(yàn)所需內(nèi)參基因的最佳數(shù)目是3。綜合分析，推薦鐵皮

6、石斛不同組織中最佳內(nèi)參基因組合為EFlaActinGAPDH。在鐵皮石斛不同生長(zhǎng)發(fā)育階段，3個(gè)軟件的分析結(jié)果不盡相同，但3個(gè)軟件分析得出候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性最低者均為TUB，結(jié)合geNorm軟件推薦的該試驗(yàn)條件下所需內(nèi)參基因數(shù)目是5，同時(shí)考慮試驗(yàn)成本和實(shí)際可行性，綜合推薦基因組合UBQG么PD日。在高溫(40℃)和低溫(4℃)脅迫條件下，geNorm和Bestkeeper軟件的分析結(jié)果較一致，與NormFinde軟件分析結(jié)果有所不同。

7、geNorm和Bestkeeper軟件分析均得出候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性最低者為TUA，最高者為18SrRNA。NormFinder軟件分析得出候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性最低者為GAPDH最高者為Actin。結(jié)合geNorm軟件推薦的該試驗(yàn)條件下所需內(nèi)參基因是5，同時(shí)考慮試驗(yàn)成本和實(shí)際可行性，綜合推薦基因組合為TUB18SrRNA。在干旱脅迫條件下，3個(gè)內(nèi)參基因穩(wěn)定性評(píng)估軟件的分析結(jié)果較一致。3個(gè)軟件分析均得出候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性最低者為T