1、豬輪狀病毒感染(Porcine rotavirus，PoRV)是一種嚴(yán)重的接觸性腸道傳染病，導(dǎo)致仔豬出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、脫水和消瘦等臨床癥狀，也能夠致使仔豬死亡，特別是對(duì)7日齡左右的仔豬造成的危害最為嚴(yán)重。該病主要暴發(fā)于寒冷時(shí)期的冬季以及早春時(shí)節(jié)，且傳播迅速，給養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)帶來(lái)巨大的損失?，F(xiàn)階段實(shí)驗(yàn)室對(duì)PoRV病原的檢測(cè)主要是利用常規(guī)RT-PCR方法，但是常規(guī)RT-PCR方法相對(duì)于熒光定量RT-PCR靈敏度較低。常規(guī)RT-PCR只能檢測(cè)到發(fā)病嚴(yán)

2、重時(shí)期的豬只，對(duì)輪狀病毒感染早期的豬只，則需要靈敏度更高的檢測(cè)方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，以達(dá)到在豬感染的潛伏期就可以診斷并采取有效的防控措施來(lái)減少PoRV的暴發(fā)帶來(lái)的損失。
　　 本試驗(yàn)主要是為臨床檢測(cè)PoRV建立靈敏性更高的TaqMan熒光定量RT-PCR方法。根據(jù)GenBank中登錄的A群豬輪狀病毒(PoRV)TM-a毒株序列，我們針對(duì)結(jié)構(gòu)蛋白VP6基因設(shè)計(jì)了一對(duì)常規(guī)RT-PCR特異性引物和一對(duì)熒光定量RT-PCR特異性引物和探針，將通過(guò)

3、常規(guī)RT-PCR擴(kuò)增VP6獲得的目的片段與pMD-18T載體連接構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒，建立了檢測(cè)A群PoRV的TaqMan熒光定量RT-PCR方法，并對(duì)該方法的敏感性、特異性和重復(fù)性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。通過(guò)熒光定量RT-PCR反應(yīng)獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，反應(yīng)中模板DNA的量與熒光定量RT-PCR的CT值呈一定的線性關(guān)系，且得其直線方程是y=-3.979gx+43.152，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.997。此方法可以檢測(cè)出最低的PoRV的cDNA濃度為4.6×10

4、2 copies/μL。在跟常規(guī)RT-PCR檢測(cè)方法進(jìn)行對(duì)比后得知，新方法的敏感度要比常規(guī)RT-PCR方法高100倍。用該方法檢測(cè)豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(PRRSV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬圓環(huán)病毒(PCV2)均為陰性。研究結(jié)果表明，該方法敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，因此對(duì)豬群的早期感染體內(nèi)低病毒拷貝數(shù)時(shí)都能做出準(zhǔn)確的判斷，對(duì)防治PoRV的暴發(fā)

5、能夠起到重要作用。
　　 用本實(shí)驗(yàn)室分離的豬輪狀病毒TM-a毒株對(duì)三日齡仔豬進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，此毒株的TCID50為10-6.58/0.1ml，用新建立的熒光定量RT-PCR方法測(cè)得病毒液的病毒拷貝數(shù)為1.8×106 copies/μL。選取PoRV陰性的16頭三日齡仔豬，分成4組:空白對(duì)照組，口服4×106 TCID50的低劑量組，口服2×107 TCID50的中劑量組，口服1×108 TCID50的高劑量組。本研究成功地復(fù)制出了

6、輪狀病毒感染仔豬的病理模型:高、中、低劑量組分別于第12h、18h、30h采集的糞拭子開(kāi)始檢測(cè)到病毒，并且分別于36h、48h、60h開(kāi)始出現(xiàn)腹瀉、嘔吐、脫水等癥狀;通過(guò)熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)試驗(yàn)仔豬攻毒后每隔6h的糞拭子PoRV拷貝數(shù)，探索豬感染PoRV后的排毒規(guī)律，結(jié)果表明，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)糞樣中的病原拷貝數(shù)也增加，并且在96h達(dá)到峰值1.8×107copies/μL;通過(guò)病理組織切片HE染色發(fā)現(xiàn)，攻毒組小腸出現(xiàn)嚴(yán)重病變，腸絨毛