1、卵泡腔形成階段是腔前卵泡發(fā)育最為關鍵的階段之一，自然狀況下絕大部分卵泡會在此階段發(fā)生閉鎖退化。優(yōu)化豬腔前卵泡體外培養(yǎng)體系，探究卵泡成腔機制，不僅可為豬胚胎工程研究與應用提供充足的卵源，而且可為提高人類腔前卵泡體外培養(yǎng)效率提供借鑒。本研究對豬腔前卵泡體外培養(yǎng)體系進行了優(yōu)化，并對可能參與卵泡成腔的基因進行了篩選，試驗內(nèi)容如下：
　　試驗一、豬PFs-OGCs體外培養(yǎng)方式的比較。通過對豬PFs-OGCs體外有血清貼壁培養(yǎng)與無血清懸浮培養(yǎng)

2、16.5 d后，觀察兩種培養(yǎng)方法下的OGCs形態(tài)，并比較PFs-OGCs成活率、成腔率，發(fā)現(xiàn)OGCs經(jīng)體外懸浮培養(yǎng)與貼壁培養(yǎng)均能夠形成腔樣結構，但貼壁培養(yǎng)獲取OGCs的成活率、成腔率顯著高于懸浮培養(yǎng)(P<0.05)。
　　試驗二、豬PFs-OGCs體外貼壁培養(yǎng)培養(yǎng)時間的篩選。通過對豬PFs-OGCs體外貼壁培養(yǎng)16.5 d、18.5 d和20.5 d后，比較PFs-OGCs成活率、成腔率、卵母細胞直徑以及經(jīng)IVM后成熟率，并對體外

3、培養(yǎng)卵母細胞在皮質顆粒分布、ROS水平以及卵母細胞超微結構上與體內(nèi)卵母細胞進行對比來評價卵母細胞質量。發(fā)現(xiàn)體外貼壁培養(yǎng)16.5 d的PFs-OGCs內(nèi)的卵母細胞直徑顯著小于18.5 d、20.5 d試驗組（P<0.05）；16.5 d試驗組成活率顯著高于20.5 d組（P<0.05）；而體外培養(yǎng)18.5 d組的卵母細胞成熟率顯著高于16.5 d與20.5 d組（P<0.05)；各組間的成腔率無顯著差異（P＞0.05）。體外培養(yǎng)18.5

4、d的卵母細胞皮質顆粒分布、ROS水平、成熟線粒體的比例及高爾基體形態(tài)、數(shù)量與分布均與體內(nèi)來源的卵母細胞無明顯差異，但其透明帶厚度顯著小于體內(nèi)卵母細胞（P<0.05)，脂肪堆積較多、脂滴直徑較?。≒<0.05)。
　　試驗三：參與卵泡腔形成的基因篩選。分離豬PFs-OGCs和EAFs-OGCs并進行轉錄組測序（RNA-Seq），通過生物信息學方法篩選出差異表達基因。發(fā)現(xiàn)EAFs-OGCs上共31個基因上調，13個基因下調；通過GO分

5、析和Pathway分析，它們主要為參與核糖體信號通路、蛋白質消化和吸收信號通路上的基因。此外，初步篩選出HPGDS、STMY1、DPPA5、MCT4、FTH1、MHC、γ-TG、fibronectin共8個可能與卵泡囊腔形成相關的重點候選基因。
　　結論：
　　1.體外貼壁培養(yǎng)18.5 d是豬PFs-OGCs最優(yōu)培養(yǎng)體系；
　　2.HPGDS、STMY1、DPPA5、MCT4、FTH1、MHC、γ-TG、fibrone