1、第一部分氨肽酶N的研究背景
　　 氨肽酶N(Aminopeptidase N，APN，CD13)是鋅離子依賴性金屬蛋白酶M1家族的一種膜結(jié)合型外肽酶，以同源二聚體的形式跨膜結(jié)合于細(xì)胞表面。腫瘤細(xì)胞生物學(xué)研究表明，氨肽酶N高表達(dá)于多種惡性腫瘤細(xì)胞，通過其蛋白水解酶功能，在惡性腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成等過程中通過降解細(xì)胞間基質(zhì)，對(duì)腫瘤的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移起著促進(jìn)的作用。研究證明，APN在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用包括：(1)降解細(xì)胞間基

2、質(zhì)，直接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移；(2)降解細(xì)胞間基質(zhì)，因而造成多種生長(zhǎng)因子的釋放，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖；(3)刺激與血管生成相關(guān)的細(xì)胞因子的釋放，促進(jìn)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞管狀結(jié)構(gòu)的形成。
　　 血管生成是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，僅發(fā)生于新生兒、成人愈傷時(shí)期或惡性腫瘤。當(dāng)原發(fā)或繼發(fā)腫瘤的體積超過1～2mm3時(shí)，必須發(fā)展新生血管提供足夠的血液供應(yīng)，才能夠繼續(xù)增殖；腫瘤的轉(zhuǎn)移也往往伴隨血管生成。血管生成包括內(nèi)皮細(xì)胞透過基底膜侵襲、轉(zhuǎn)移、粘附和增

3、殖等過程，并最終在腫瘤組織內(nèi)形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。細(xì)胞間基質(zhì)的主要成分是膠原蛋白、硫酸乙酰蛋白聚糖、纖維粘連蛋白和層粘連蛋白等，通過以膠原蛋白和蛋白聚糖為基本骨架的纖維網(wǎng)狀復(fù)合物，在細(xì)胞之間相互聯(lián)系，維持細(xì)胞連接的穩(wěn)定性和襄助細(xì)胞間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。同時(shí)，這也成為了腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的障礙，因此降解和侵襲基底膜是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和新生血管生成的第一步。
　　 由于APN與腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成關(guān)系密切，因此靶向于APN的藥物已成為抗腫瘤侵襲、

4、轉(zhuǎn)移和抗血管生成方面研究的熱點(diǎn)。從網(wǎng)狀橄欖鏈霉菌培養(yǎng)液中提取的天然產(chǎn)物Bestatin被發(fā)現(xiàn)能夠抑制APN的活性，其作為免疫增強(qiáng)劑于1987年在日本上市。至今，許多國(guó)家的學(xué)者仍在致力于研究其在高劑量下作為APN抑制劑時(shí)對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移和血管生成的作用，并且已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展。
　　 第二部分目標(biāo)化合物的合理設(shè)計(jì)與合成
　　 本研究的特色在于，運(yùn)用類肽設(shè)計(jì)的原理，以脲基代替?zhèn)鹘y(tǒng)天然肽類化合物的酰胺鍵(肽鍵)作為連接基團(tuán)，以非肽

5、化學(xué)基團(tuán)取代天然肽類化合物的氨基酸殘基作為改良后的藥效團(tuán)，連接APN天然底物中水解頻率較高的堿性或中性氨基酸殘基，構(gòu)建了小分子脲基類肽化合物庫；將計(jì)算機(jī)虛擬對(duì)接與活性測(cè)試實(shí)際結(jié)果相結(jié)合，對(duì)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造和優(yōu)化，包括對(duì)連接部分和側(cè)鏈進(jìn)行合理設(shè)計(jì)，并實(shí)現(xiàn)定向合成。本研究中所設(shè)計(jì)的化合物，經(jīng)過幾輪結(jié)構(gòu)改造，得到了抑酶活性明顯提高的一類先導(dǎo)化合物，并對(duì)活性較好的幾個(gè)化合物在抗腫瘤轉(zhuǎn)移和抗血管生成方面進(jìn)行了進(jìn)一步的抗腫瘤機(jī)制研究和動(dòng)物體內(nèi)藥效

6、學(xué)研究。所得結(jié)果有助于日后進(jìn)一步優(yōu)化APN抑制劑的骨架和藥效團(tuán)，建立完整的APN抑制劑的抗腫瘤機(jī)制評(píng)價(jià)研究和體內(nèi)藥效學(xué)模型。本文中所設(shè)計(jì)的化合物具有進(jìn)一步開發(fā)的價(jià)值。
　　 本文在基于生物靶標(biāo)的合理藥物設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上，本著結(jié)構(gòu)多樣性的原則，對(duì)化合物進(jìn)行了包括側(cè)鏈、取代基和連接基團(tuán)在內(nèi)的三個(gè)方面的結(jié)構(gòu)優(yōu)化，設(shè)計(jì)了兩種合成工藝路線，完成了三個(gè)系列82個(gè)目標(biāo)化合物的合成。合成方法充分體現(xiàn)了小分子類肽合成的優(yōu)勢(shì)，工藝路線切實(shí)可行，轉(zhuǎn)化率和

7、分離收率較高。
　　 本文以兩種合成方法完成了對(duì)三個(gè)系列目標(biāo)化合物的合成：(一)、為了探討氨基酸側(cè)鏈和非肽取代基團(tuán)部分不同取代基對(duì)活性的影響，我們采用不同的脂肪胺或芳香胺為起始原料，經(jīng)三光氣轉(zhuǎn)化為異氰酸酯，然后與不同的氨基酸甲酯以脲基相連接，再將甲酯轉(zhuǎn)化為異羥肟酸，得到目標(biāo)產(chǎn)物；(二)、為了探討不同的連接基團(tuán)或氨基酸側(cè)鏈、以及鋅離子螯合基團(tuán)(ZBG)對(duì)活性的影響，我們采用了以氨基酸甲酯鹽酸鹽為起始原料，經(jīng)三光氣轉(zhuǎn)化為異氰酸酯，然

8、后與不同的醇或氨基酸甲酯以氨基甲酸酯或脲基相連接，再將甲酯部分保留或轉(zhuǎn)化羧酸或者為異羥肟酸，得到目標(biāo)產(chǎn)物。對(duì)于所得的化合物結(jié)構(gòu)，通過核磁共振氫譜、碳譜、高分辨質(zhì)譜確證；純度經(jīng)元素分析和高效液相色譜法檢測(cè)，均為95％以上。經(jīng)文獻(xiàn)檢索證實(shí)，所合成的目標(biāo)化合物為新化學(xué)實(shí)體，未見文獻(xiàn)報(bào)道。
　　 第三部分目標(biāo)化合物的體內(nèi)外生物活性評(píng)價(jià)及其抗腫瘤機(jī)制研究
　　 本文設(shè)計(jì)合成了三個(gè)系列共82個(gè)小分子類肽化合物，并對(duì)其針對(duì)豬腎來源的A

9、PN(microsomal，sigma)的抑酶活性進(jìn)行了初步篩選。針對(duì)初步篩選中得到的活性優(yōu)于陽性對(duì)照bestatin(烏苯美司)的化合物，則對(duì)其抑酶活性進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，包括其對(duì)高表達(dá)APN的小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16BL6和人卵巢透明細(xì)胞癌細(xì)胞ES-2細(xì)胞表面APN酶活的抑制能力、對(duì)這兩種細(xì)胞生存能力的影響，和對(duì)同為鋅離子依賴性金屬蛋白酶和細(xì)胞間基質(zhì)(ECM)水解酶的基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2酶活性的選擇性進(jìn)行了研究。以上篩選所得到對(duì)A

10、PN活性最優(yōu)、選擇性最高并且對(duì)兩種腫瘤細(xì)胞生存影響最小的化合物，則對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的抗侵襲和抗血管生成機(jī)制研究。根據(jù)機(jī)制研究的結(jié)果，挑選最優(yōu)者進(jìn)行體內(nèi)抗轉(zhuǎn)移和抗血管生成藥效學(xué)研究。
　　 酶抑制活性測(cè)試顯示，ZBG的有無和螯合強(qiáng)度對(duì)活性的影響很大，連接部分、氨基酸側(cè)鏈和非肽基團(tuán)的結(jié)構(gòu)對(duì)活性也有重要的影響。78個(gè)化合物中約有一半的酶抑制活性要優(yōu)于陽性對(duì)照烏苯美司，其中十多個(gè)化合物的半數(shù)抑制濃度(IC50)低于烏苯美司一個(gè)數(shù)量級(jí)或以上

11、。這說明脲基類肽化合物作為小分子APN抑制劑具有很大的潛力。并且，活性最優(yōu)的幾個(gè)化合物對(duì)MMP-2抑制活性很低甚至沒有，說明其具有很好的靶點(diǎn)選擇性；對(duì)兩種腫瘤細(xì)胞的生存能力在很高的濃度幾無影響，其用MTT法所測(cè)得的半數(shù)生長(zhǎng)抑制濃度(GI50)均大于已上市的烏苯美司，說明可能是一類非細(xì)胞毒類化合物。
　　 體外機(jī)制研究包括兩部分，抗侵襲和抗血管生成?？骨忠u研究采用的是包被Matrigel的transwell法；抗血管生成采用的則是

12、大鼠主動(dòng)脈環(huán)微血管生成測(cè)試和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)成管腔測(cè)試，也需以Matrigel為基質(zhì)。Matrigel是小鼠EHS肉瘤所分泌的細(xì)胞間基質(zhì)，是用于代替ECM進(jìn)行多種相關(guān)的體外機(jī)制研究的商品化產(chǎn)品?？骨忠u測(cè)試的結(jié)果表明，脲基類肽3-11、3-19、3-36、3-34、3-40和3-45可以在對(duì)細(xì)胞遷移能力幾無影響的情況下顯著抑制惡性腫瘤細(xì)胞ES-2的侵襲，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。大鼠主動(dòng)脈環(huán)和HUVEC成管腔測(cè)試的結(jié)果顯示，脲基

13、類肽3-11、3-19、3-36、3-40和3-45具有顯著的體外抗血管生成作用。
　　 脲基類肽化合物的體內(nèi)抗轉(zhuǎn)移和抗血管生成藥效學(xué)試驗(yàn)采用了兩種模型，分別為人工肺轉(zhuǎn)移模型和腫瘤引發(fā)的皮內(nèi)血管生成模型。兩種模型選擇的動(dòng)物為C57BL/6小黑鼠，瘤株為B16BL6小鼠黑色素瘤。體內(nèi)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，脲基類肽3-36、3-40和3-45可以較為顯著地抑制小鼠黑色素瘤人工肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的形成，抑制率分別為33.5％、37.7％和50.

14、3％；脲基類肽3-36、3-40和3-45在抗血管生成模型中也能夠明顯地抑制腫瘤細(xì)胞引發(fā)的血管生成，抑制率分別為61.7％、57.5％和67.8％。
　　 體內(nèi)藥效學(xué)試驗(yàn)所選擇的3個(gè)化合物其在抑酶活性、體外機(jī)制研究和體內(nèi)藥效學(xué)測(cè)試中的表現(xiàn)具有良好的相關(guān)性，活性均優(yōu)于陽性對(duì)照烏苯美司，表明此3個(gè)化合物具有成為抗腫瘤候選藥物的潛力。
　　 第四部分目標(biāo)化合物的構(gòu)效關(guān)系研究
　　 我們選擇了在抑酶活性初篩中獲得的三個(gè)代

15、表性的脲基類肽小分子APN抑制劑1-18、3-11和3-45，對(duì)它們進(jìn)行虛擬對(duì)接研究，以期考察其與靶點(diǎn)的結(jié)合模式，指導(dǎo)下一步的化合物設(shè)計(jì)和修飾改造。虛擬對(duì)接以E.coli的APN(eAPN)的晶體結(jié)構(gòu)作為受體，在還原晶體復(fù)合物結(jié)構(gòu)中Bestatin的構(gòu)象后，則以該對(duì)接條件對(duì)這三個(gè)化合物進(jìn)行對(duì)接。對(duì)接發(fā)現(xiàn)，化合物1-18和3-11均采取了與Bestatin相似的結(jié)合模式，而化合物3-45的萘基部分則延伸向了不同的方向。我們推測(cè)，這可能成為

16、化合物1-18和3-11具有較好的抑酶活性、以及抑酶活性在化合物3-45上出現(xiàn)突破的原因。
　　 第五部分結(jié)論
　　 本課題所設(shè)計(jì)的脲基類肽小分子APN抑制劑具有很好的APN抑酶活性。我們?cè)隗w外機(jī)制研究和體內(nèi)藥效學(xué)研究方面主要集中于APN作為腫瘤細(xì)胞表面標(biāo)記物和降解ECM的金屬蛋白酶所發(fā)揮的生理和病理功能，即腫瘤轉(zhuǎn)移和腫瘤引發(fā)的血管生成，建模成功并且取得了顯著的抗腫瘤結(jié)果。體內(nèi)外研究結(jié)果顯示，脲基類肽化合物具有作為先導(dǎo)物