1、研究背景:氨肽酶N(APN/CD13；EC3.4.11.2),是一類鋅離子依賴性金屬蛋白酶,其廣泛存在于人的多種組織中,在不同細(xì)胞(上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和白細(xì)胞等)表面均有表達(dá)。相比于正常細(xì)胞,該酶在腫瘤細(xì)胞表面高水平表達(dá),其在惡性腫瘤生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移以及新血管的形成過程中扮演重要角色,成為研究抗癌藥物的一個(gè)重要靶點(diǎn)。
　　 目前,已有報(bào)道的天然抑制劑如:Bestatin,Probestatin,Amastatin,C

2、urcumin等在預(yù)防和治療腫瘤方面取得一定的積極效果。Bestatin作為第一個(gè)上市的APN抑制劑,臨床上已經(jīng)用于治療急性成年人非淋巴性白血病。另外,人們還合成了許多小分子APN抑制劑,如α-氨基磷酸類抑制劑,β-氨基硫醇類抑制劑,以及本課題組報(bào)道的環(huán)酰亞胺類抑制劑,L-賴氨酸衍生物抑制劑等。
　　 本研究以APN為靶點(diǎn),設(shè)計(jì)合成了一系列小分子類肽化合物,并對(duì)其進(jìn)行初步的生物活性篩選,以期發(fā)現(xiàn)具有良好APN抑制活性的抗癌先導(dǎo)化

3、合物。
　　 研究方法:在本實(shí)驗(yàn)室前期研究工作中發(fā)現(xiàn)的活性先導(dǎo)物1,2-二氨基-3-苯丙烷結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上,結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研,解析APN的三維晶體結(jié)構(gòu)及其與抑制劑的作用模式和特點(diǎn),選擇了與該活性結(jié)構(gòu)相類似的氯霉胺為基本骨架,并在此基礎(chǔ)上選擇能與酶活性中心的疏水性口袋相互作用的不同側(cè)鏈與之拼合進(jìn)行衍生化。結(jié)構(gòu)修飾主要考慮以下三個(gè)因素:1)引入不同體積和長(zhǎng)度的疏水側(cè)鏈,考察立體效應(yīng)對(duì)酶的作用。2)側(cè)鏈中選擇不同的吸電子基和斥電子基,考察不同電

4、性效應(yīng)對(duì)酶的作用。3)側(cè)鏈中選擇可能與酶相互作用的氫鍵基團(tuán),以增強(qiáng)化合物與酶的親和力。本研究綜合利用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)軟件的優(yōu)勢(shì),對(duì)設(shè)計(jì)的化合物與酶進(jìn)行柔性對(duì)接打分,選擇分值較高的化合物進(jìn)行化學(xué)合成。同時(shí),對(duì)其分子量、脂水分配系數(shù)、氫鍵受體和氫鍵供體數(shù)進(jìn)行了預(yù)測(cè),采用Lipinski規(guī)則進(jìn)一步篩選,最終設(shè)計(jì)了三個(gè)系列115個(gè)全新結(jié)構(gòu)的目標(biāo)化合物。目標(biāo)化合物的合成以氯霉胺為起始原料,采用了氨基保護(hù),選擇性氧化,溴代,疊氮化,還原,縮合等多

5、個(gè)反應(yīng)步驟完成,采用紅外光譜、核磁共振氫譜、電噴霧質(zhì)譜、X-ray單晶衍射等方法確證其化學(xué)結(jié)構(gòu)。
　　 生物活性研究選用體外抑酶(APN,MMP-2)活性試驗(yàn)、腫瘤細(xì)胞(HL-60,ES-2,K549等)生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)和小鼠體內(nèi)抗腫瘤轉(zhuǎn)移試驗(yàn)對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行了初步活性評(píng)價(jià),從中篩選出具有較好活性的氯霉胺類APN抑制劑作為抗癌先導(dǎo)化合物。
　　 研究結(jié)果:本研究最終合成了115個(gè)目標(biāo)化合物,其中大部分化合物產(chǎn)率較高,純度良好

6、,所有化合物進(jìn)行了化學(xué)結(jié)構(gòu)確證。經(jīng)文獻(xiàn)檢索,所合成的目標(biāo)化合物為新型結(jié)構(gòu),未見相關(guān)報(bào)道。
　　 本研究合成的78個(gè)A系列目標(biāo)化合物中,大部分化合物對(duì)APN具有抑制活性,其中化合物9e(9e’),9m(9m’),9r(9r’)和9s(9s’)活性較好。B系列化合物相比于A系列化合物,整體上活性有明顯提高。其中,化合物12w,12x和12y的IC50在35μM以下,接近于陽(yáng)性對(duì)照藥Bestatin的APN抑制活性。然而,B系列化合物

7、同樣也顯示出較強(qiáng)的MMP-2抑制活性。在C系列中,化合物16k,161與陽(yáng)性對(duì)照藥Bestatin的活性相當(dāng),且對(duì)MMP-2的抑制活性較低,顯示了良好的抑酶選擇性。
　　 本研究在對(duì)上述目標(biāo)化合物進(jìn)行抑酶活性試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行了初步定量構(gòu)效關(guān)系研究。采用比較分子力場(chǎng)分析方法(CoMFA)建立了具有較高的交叉驗(yàn)證系數(shù)q2和一定預(yù)測(cè)能力的定量構(gòu)效關(guān)系(QSAR)模型。通過對(duì)CoMFA模型立體場(chǎng)等勢(shì)線圖和靜電場(chǎng)等勢(shì)線圖的

8、分析,提出了化合物下一輪結(jié)構(gòu)優(yōu)化的方案,為氯霉胺類APN抑制劑的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 體外細(xì)胞抑瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,多數(shù)化合物對(duì)高表達(dá)APN的腫瘤細(xì)胞顯示出良好的抑制效果。其中,化合物161、12w表現(xiàn)出與陽(yáng)性對(duì)照藥相當(dāng)?shù)哪[瘤細(xì)胞抑制活性。
　　 體內(nèi)小鼠抗腫瘤轉(zhuǎn)移試驗(yàn)結(jié)果證明,化合物12w和161均有一定的抑制荷肝癌H22小鼠腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用。其中,化合物12w的抑制率為48.51％,小于陽(yáng)性對(duì)照藥Bestati

9、n(抑制率為58.04％),161的抑制率達(dá)到了56.49％,接近陽(yáng)性對(duì)照藥Bestatin。
　　 研究結(jié)論:本研究基于 APN的晶體結(jié)構(gòu)及抑制劑與酶的作用模式,借助計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行合理藥物設(shè)計(jì)并合成的氯霉胺類化合物具有較好的APN抑制活性。所設(shè)計(jì)的合成路線科學(xué)合理,起始原料經(jīng)濟(jì)易得。通過初步的活性測(cè)試發(fā)現(xiàn)了具有進(jìn)一步研究?jī)r(jià)值的活性化合物。其中,化合物12w,161可以作為抗癌先導(dǎo)化合物用于下一輪的結(jié)構(gòu)優(yōu)化。同時(shí),基于化合物結(jié)構(gòu)