1、研究背景和目的:創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic brain injury,TBI)不僅導(dǎo)致皮層細(xì)胞死亡,也會(huì)誘導(dǎo)繼發(fā)性海馬細(xì)胞死亡。創(chuàng)傷性腦損傷是神經(jīng)外科常見(jiàn)病,在我國(guó)年發(fā)病率為55.4人/10萬(wàn)人口,并呈逐年上升趨勢(shì)。TBI常見(jiàn)的后遺癥包括外傷后癲癇和記憶障礙等,嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量,這些后遺癥發(fā)生的神經(jīng)學(xué)基礎(chǔ)尚不清楚。單側(cè)的打擊可以通過(guò)腦組織傳遞到對(duì)側(cè),但是在通過(guò)腦組織和其他顱內(nèi)組織時(shí)壓力顯著減小,所以液壓打擊對(duì)對(duì)側(cè)腦組織的影

2、響較小。以前已有報(bào)道創(chuàng)傷性腦損傷誘導(dǎo)的海馬區(qū)高興奮性,但是多數(shù)研究集中在對(duì)海馬齒狀回創(chuàng)傷后神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)改變的研究。針對(duì)齒狀回創(chuàng)傷后出現(xiàn)的高興奮性,人們提出了不同理論。Lowenstein等發(fā)現(xiàn),對(duì)單側(cè)腦半球的打擊可引起海馬齒狀回顆粒細(xì)胞的高興奮性和表達(dá)生長(zhǎng)抑素的海馬齒狀回門(hi-1ar)細(xì)胞的減少,提出了齒狀回門細(xì)胞的“選擇性易損傷”學(xué)說(shuō)。Santhakumar等認(rèn)為,創(chuàng)傷后齒狀回門中間神經(jīng)元并沒(méi)有選擇性易損傷,認(rèn)為門結(jié)構(gòu)對(duì)于損傷后齒狀回

3、顆粒細(xì)胞活動(dòng)的加強(qiáng)是必需的,創(chuàng)傷后門結(jié)構(gòu)中的苔蘚細(xì)胞對(duì)來(lái)自perforant通路的刺激反應(yīng)增強(qiáng),由此提出了“易激惹苔蘚細(xì)胞”假說(shuō)。因此,海馬齒狀回一直被認(rèn)為濾過(guò)異常傳入信號(hào)進(jìn)入CA3區(qū)的一道屏障,CA3區(qū)將傳入的信號(hào)進(jìn)行擴(kuò)大,然后通過(guò)CA1區(qū)將信號(hào)傳遞到大腦皮層。因此,在CA3和CA1之間進(jìn)行切斷,有助于減少創(chuàng)傷后來(lái)自齒狀回的異常上位傳入信號(hào)對(duì)CA1區(qū)神經(jīng)元興奮性的影響,更易于相對(duì)獨(dú)立研究CA1區(qū)的Schaffer側(cè)支單突觸傳遞通路。<

4、br>　　 腦損傷是神經(jīng)外科醫(yī)師工作中常見(jiàn)的問(wèn)題,多見(jiàn)于機(jī)械性撞擊、交通事故、暴力侵害造成。腦損傷不但奪去為數(shù)不少人的生命,而且還造成大量腦外傷后遺癥,構(gòu)成對(duì)患者家庭及社會(huì)的沉重負(fù)擔(dān)。建立腦損傷(TBI)動(dòng)物模型的方法主要有兩大類:液壓沖擊模型(FP)和控制性腦皮質(zhì)撞擊模型(IC)。腦損傷除造成腦結(jié)構(gòu)形態(tài)破壞,缺氧缺血神經(jīng)細(xì)胞壞死外,尚可發(fā)生大量神經(jīng)細(xì)胞凋亡。眾所周知,神經(jīng)細(xì)胞凋亡不同于壞死,它是正常生理狀態(tài)下細(xì)胞死亡模式。海馬結(jié)構(gòu)具

5、有高度有序化的板層且各種神經(jīng)成分相對(duì)獨(dú)立分布,可作為研究腦的理想模型。海馬結(jié)構(gòu)由海馬、齒狀回、下托(subiculum)、束狀回和灰被組成。它從室間孔處延至側(cè)腦室下角頂部,全形呈弓形,屬古皮質(zhì)。以胼胝體為標(biāo)志可把海馬結(jié)構(gòu)分成上、下部。海馬皮質(zhì)可分為多形層、錐體層和分子層。錐體細(xì)胞規(guī)則排列的形式?jīng)Q定了整個(gè)海馬的結(jié)構(gòu)模式。就整體來(lái)講海馬的結(jié)構(gòu)是比較一致的,但依據(jù)細(xì)胞構(gòu)筑的不同可再將其劃分成四個(gè)區(qū),分別命名為CA1、CA2、CA3和CA4區(qū),

6、“CA"是Am-mon角(cornu ammonis)的縮寫(xiě)。CA4緊鄰齒狀回,CA1與下托相連接。海馬在人類和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中是TB1后最脆弱的腦部區(qū)域之一。海馬結(jié)構(gòu)是研究較多的與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)的腦區(qū),它不僅和陳述記憶有關(guān),而且還涉及認(rèn)知功能和位置導(dǎo)航,是一個(gè)重要的信息處理部位。大量研究已證明與學(xué)習(xí)記憶特別是空間認(rèn)知功能有關(guān)。尤其CA3區(qū)被認(rèn)為與空間辨別性學(xué)習(xí)記憶活動(dòng)的關(guān)系尤為密切。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,人們發(fā)現(xiàn)損毀海馬能促進(jìn)操作性逃避的學(xué)習(xí),但

7、可減弱在“T”迷宮逃避足部電擊的視覺(jué)辨別問(wèn)題的學(xué)習(xí)。也有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,海馬突觸體內(nèi)游離鈣特異性的升高與動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶的減退相一致。雙側(cè)海馬損傷的患者,當(dāng)他們?cè)谝欢螘r(shí)間內(nèi)集中注意力,雖可記住一個(gè)短句或一個(gè)短位數(shù)字,但當(dāng)患者把注意力轉(zhuǎn)向某些其它事物時(shí),即使是片刻,也將完全忘記這個(gè)短句或短位數(shù)字。這種障礙使患者不能學(xué)習(xí)新事物,也不能記憶最近的經(jīng)歷,但對(duì)發(fā)病前獲得的技能以及生活中曾發(fā)生的事情,仍有良好記憶。海馬與記憶有著密切的聯(lián)系,海馬通過(guò)腦干網(wǎng)

8、狀結(jié)構(gòu)系統(tǒng)及皮質(zhì)下行纖維接受來(lái)自視、聽(tīng)、觸、痛等多種感覺(jué)信息,并參與調(diào)節(jié)內(nèi)分泌活動(dòng)。
　　 我們之前發(fā)現(xiàn),中度TBI后,海馬中多數(shù)死亡細(xì)胞主要僅限于海馬齒狀回,海馬齒狀回內(nèi)神經(jīng)形成在整個(gè)生命周期內(nèi)都是持續(xù)不斷的。細(xì)胞類型和細(xì)胞生成分析發(fā)現(xiàn),海馬齒狀回內(nèi)死亡的細(xì)胞是新生2～3周的未成熟顆粒神經(jīng)元。1973年Bliss第一次發(fā)現(xiàn)在家兔海馬齒狀回具有強(qiáng)直刺激引起突觸功效的強(qiáng)直后增強(qiáng)現(xiàn)象,當(dāng)用短串高頻電刺激海馬的興奮性傳入神經(jīng)時(shí),海馬突

9、觸傳遞可在數(shù)秒鐘內(nèi)增強(qiáng),且持續(xù)時(shí)間在10h以上,特稱之為長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)。LTP是突觸活動(dòng)的易化現(xiàn)象,被視為突觸可塑性的一個(gè)模式,習(xí)慣上把具有這種性質(zhì)的突觸稱為可塑性突觸。肖鵬等進(jìn)一步驗(yàn)證了LTP出現(xiàn)的快慢與條件反應(yīng)建立的快慢(個(gè)體差異)相吻合,即在明暗辨別學(xué)習(xí)中出現(xiàn)突觸效應(yīng)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng),保持時(shí)間的長(zhǎng)短與鞏固性訓(xùn)練的多少呈正相關(guān),且LTP消退,習(xí)得性行為也消退。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在條件反應(yīng)的建立過(guò)程中,產(chǎn)生突觸效應(yīng)LTP；在條件反應(yīng)的鞏固過(guò)程

10、中,LTP繼續(xù)保持；當(dāng)條件反應(yīng)消退,LTP也消退；在條件反應(yīng)的再建立過(guò)程中,再次產(chǎn)生LTP,而且這種習(xí)得性LTP的發(fā)展和變化超前于習(xí)得性行為的產(chǎn)生和改變。以上資料表明LTP可能是學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)基礎(chǔ),特別在運(yùn)動(dòng)學(xué)習(xí)過(guò)程中對(duì)新的神經(jīng)回路的形成起著重要作用。本研究結(jié)果表明,TBI后大多數(shù)的新生神經(jīng)死亡發(fā)生在24h內(nèi),然后在一個(gè)低水平保持至少2w。死亡的未成熟粒細(xì)胞多數(shù)沒(méi)有表現(xiàn)出細(xì)胞凋亡形態(tài)特征,凋亡標(biāo)記物幾乎顯示陰性。相反,他們共同表達(dá)受體相

11、互作用蛋白(RIP-1,一種壞死標(biāo)記物)顯示未成熟的神經(jīng)細(xì)胞因壞死而死亡。從而表明,中度TBI可引發(fā)海馬內(nèi)未成熟神經(jīng)元的快速壞死性死亡。學(xué)習(xí)記憶是神經(jīng)系統(tǒng)特別是中樞神經(jīng)系統(tǒng)各部相互作用,共同完成的復(fù)雜過(guò)程。不僅依賴于神經(jīng)元構(gòu)成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)性的多層次神經(jīng)元環(huán)路,而且還依賴于環(huán)路中每個(gè)神經(jīng)元的神經(jīng)介質(zhì)的正常調(diào)節(jié)。研究顯示海馬結(jié)構(gòu)與學(xué)習(xí)記憶,特別是空間辨別性學(xué)習(xí)記憶功能關(guān)系密切,海馬結(jié)構(gòu)內(nèi)構(gòu)成了明確的突觸通路,海馬內(nèi)突觸通路的完整對(duì)各類學(xué)習(xí)記憶

12、的功能是非常重要的。提示防止海馬內(nèi)細(xì)胞死亡的治療應(yīng)以未成熟神經(jīng)細(xì)胞作為目標(biāo),在損傷后24h內(nèi)給予治療,以阻斷細(xì)胞壞死過(guò)程。顱腦是人體最重要的器官,腦損傷后如何挽救尚有活力的神經(jīng)細(xì)胞,減少遲發(fā)性死亡,盡量保護(hù)神經(jīng)功能,是每一位神經(jīng)科醫(yī)生都要面對(duì)的難題。近年來(lái),分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn),海馬作為腦損傷后易損區(qū),出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞延遲性死亡。目前,國(guó)內(nèi)外有關(guān)這一領(lǐng)域的研究大多局限于缺血性腦損傷,有關(guān)腦損傷后這一領(lǐng)域的研究機(jī)制尚無(wú)全面的報(bào)道。
　　

13、 聚二磷酸腺苷核糖多聚酶(poly adenosinediphosphate ribose polymerase,PARP)被認(rèn)為跟凋亡過(guò)程的啟動(dòng)相關(guān),在實(shí)驗(yàn)鼠TBI后,PARP陽(yáng)性細(xì)胞主要出現(xiàn)在海馬CA3區(qū)的錐體細(xì)胞層,海馬CA3區(qū)的錐體細(xì)胞層神經(jīng)元在經(jīng)典的海馬三突觸回路中有著重要作用和地位,無(wú)論是齒狀回顆粒細(xì)胞層.經(jīng)苔狀纖維-投射至CA3區(qū)錐體細(xì)胞層,還是CA3區(qū)錐體細(xì)胞層.經(jīng)謝弗側(cè)支.投射至CA1區(qū)錐體細(xì)胞層,都與CA3區(qū)錐體細(xì)胞

14、層相關(guān)聯(lián),海馬三突觸回路是學(xué)習(xí)、記憶的基本結(jié)構(gòu),本實(shí)驗(yàn)中,由于TBI致傷區(qū)域及海馬本身的形狀結(jié)構(gòu)使得海馬CA3區(qū)錐體細(xì)胞層是間接受損較早且較嚴(yán)重的部位,因?yàn)楹ｑR三突觸回路的受損,從而引起TBI后學(xué)習(xí)記憶能力的下降。
　　 研究方法:本實(shí)驗(yàn)采用了美國(guó)杰克遜實(shí)驗(yàn)室8～11周齡的雄性C57 BL/6小鼠48只,分組飼養(yǎng)并進(jìn)行中度可控性大腦皮層損傷(隨機(jī)分為TBI術(shù)后4h,24h,48h,3d,7d和14 d,非手術(shù)組以及對(duì)照組共8組,

15、每組6只),摘除腦部并用4％多聚甲醛(PFA)固定過(guò)夜,然后用30％的蔗糖抗凍保存48h,用冰凍切片機(jī)(Microm HM500 M)進(jìn)行連續(xù)冠狀切片(30μm)并于-20℃保存,隨后對(duì)切片進(jìn)行Fluoro-Jade B染色、免疫組織化學(xué)分析、原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記(TUNEL)檢測(cè)、定量分析和統(tǒng)計(jì)分析,用連接數(shù)碼相機(jī)(Zeiss Axio CamMRc5,Carl Zeiss Microlmaging公司)的熒光顯微鏡(Zeiss Axi

16、overt200 M CarlZeiss MicroImaging公司)對(duì)切片進(jìn)行分析。用成像軟件對(duì)圖像進(jìn)行捕獲(Axio Vision,4.0,Carl Zeiss Microlmaging公司)并用Photoshop7.0進(jìn)行組合與標(biāo)記；觀察了中度創(chuàng)傷性腦損傷對(duì)小鼠海馬未成熟神經(jīng)元學(xué)習(xí)和記憶能力的影響作用；探討了海馬結(jié)構(gòu)的可塑性與學(xué)習(xí)記憶的相關(guān)性；證實(shí)了許多細(xì)胞因子和生化物質(zhì)參與腦外傷后繼發(fā)性腦損傷與抗損傷的病理生理過(guò)程,堿性成纖維

17、細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)作為多種神經(jīng)生長(zhǎng)因子,可能與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和再生、血管再生、創(chuàng)傷愈合等密切相關(guān),能保護(hù)神經(jīng)元對(duì)抗缺氧、低血糖、興奮性氨基酸、鈣超載、自由基和一氧化氮等多種損傷,防治和減少繼發(fā)性腦損害,提高腦損傷的救治效果；研究了對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷海馬神經(jīng)元死亡的量化評(píng)估,海馬作為大腦邊緣系統(tǒng),與記憶相關(guān)性的探討正成為研究的熱點(diǎn),損傷引起遲發(fā)性神經(jīng)元壞死是近年來(lái)備受關(guān)注的課題；表明了中度創(chuàng)傷性腦損傷會(huì)引發(fā)海

18、馬中不成熟神經(jīng)元壞死性死亡,防止海馬內(nèi)細(xì)胞死亡的治療方法應(yīng)通過(guò)阻斷壞死的過(guò)程,并且以保護(hù)未成熟神經(jīng)細(xì)胞作為治療目標(biāo),最好在損傷后2411內(nèi)進(jìn)行。
　　 研究結(jié)果
　　 1.中度創(chuàng)傷性腦損傷后海馬繼發(fā)性細(xì)胞死亡主要發(fā)生在顆粒細(xì)胞層.當(dāng)我們通過(guò)一種廣泛用于死亡神經(jīng)元染色的Fluoro-Jade B染色方法研究TBI24h后海馬內(nèi)細(xì)胞死亡情況時(shí),主要在病灶周圍區(qū)域和同側(cè)海馬內(nèi)(圖1a)觀察到被FJB染成綠色的死亡細(xì)胞。海馬病灶

19、FJB-陽(yáng)性細(xì)胞的平均數(shù)量為359±21 N/mm3。在對(duì)側(cè)皮層沒(méi)有觀察到FJB-陽(yáng)性細(xì)胞。更高放大倍數(shù)的照片顯示,FJB-陽(yáng)性細(xì)胞不是均勻地分布在海馬內(nèi)-(圖1b-d),相反,他們主要位于海馬齒狀回(圖1 a-d)。海馬內(nèi)不同區(qū)域由不同類型的細(xì)胞組成,它們可能對(duì)外傷性創(chuàng)傷有不同的敏感性。我們進(jìn)一步評(píng)估了TBI24h后海馬內(nèi)不同亞區(qū)內(nèi)FJB-陽(yáng)性細(xì)胞的分布。于TBI24h后,顆粒細(xì)胞層(GCL)有291±19 N/mm3 FJB-陽(yáng)性細(xì)

20、胞,占海馬中死亡細(xì)胞總數(shù)的80.9％,然而在CA1有0.15％；在CA3有11.42％,在海馬門有5.04％,在分子層(MCL)有1.65％(圖1,餅狀圖e)。盡管海馬中FJB-陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)明顯地從創(chuàng)傷性腦損傷后24h的359±21 N/mm3明顯地減少到3d后的55±3 N/mm3,創(chuàng)傷性腦損傷3d后的FJB-陽(yáng)性細(xì)胞在海馬不同亞區(qū)的分布與創(chuàng)傷性腦損傷24h后的分布非常相似。顆粒細(xì)胞層(GCL)有80.02％,CA1有2-37％；CA

21、3有12.80％；海馬門有0.84％；在分子層(MCL)有0.96％(圖1,餅狀圖f)。為了評(píng)估沿海馬齒狀回的死亡細(xì)胞分布格局,我們量化了中心區(qū)域,以及中心區(qū)域頭端和尾端的FJB-陽(yáng)性細(xì)胞密度。中心區(qū)域的死亡細(xì)胞密度最大,死亡細(xì)胞的密度向頭端和尾端方向慢慢降低(圖1 g)。
　　 2.創(chuàng)傷性腦損傷后齒狀回顆粒細(xì)胞層(GCL)神經(jīng)元死亡的時(shí)域分布。在損傷后的最初4h,我們觀察到在齒狀回顆粒細(xì)胞層(GCL)有相當(dāng)多數(shù)量的FJB-陽(yáng)性

22、細(xì)胞(32008.5±5584.3 N/mm3,N=6),FJB-陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量峰值出現(xiàn)在24h(38131.9±4858.2 N/mm3,N=6),48h急劇下降(9150.3±1763.8 N/mm3,N=6,P=0.008,與24 h組相比),第14d降到非常低的水平(第3d,5840.9±736.1 N/mm3,N=6；第7d,5945.0±1509.8 N/mm3,N=6；第14d,921.8±666.6N/mm3,N=6)(圖

23、2)。
　　 3.未成熟的新生神經(jīng)元對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷的耐受性。創(chuàng)傷性腦損傷后4h,在顆粒細(xì)胞層有大量的FJB-陽(yáng)性細(xì)胞(圖3a,b,d,和e)。大多數(shù)的FJB-陽(yáng)性細(xì)胞位于顆粒細(xì)胞層內(nèi)三分之一處(圖3 a,b,d,和e),其中有大多數(shù)未成熟的新生顆粒神經(jīng)元存在。正如預(yù)期,NeuN陽(yáng)性成熟顆粒神經(jīng)元位于顆粒細(xì)胞層高厚度方向上(圖3a),相反,NCAM陽(yáng)性未成熟顆粒神經(jīng)元位于顆粒細(xì)胞層內(nèi)三分之一處(圖3d)。更高功率的圖像(圖3 b)

24、和三維重建圖像(圖3c)表明,大多數(shù)FJB-陽(yáng)性細(xì)胞不與NeuN標(biāo)記物共存,表明顆粒細(xì)胞層大部分FJB-陽(yáng)性細(xì)胞不是成熟的顆粒神經(jīng)元。相反,更高分辨率的圖像(圖3 b)和三維重建圖像(圖3c)表明,大部分FJB-陽(yáng)性細(xì)胞與NCAM陽(yáng)性細(xì)胞共存,表明中度創(chuàng)傷性腦損傷后4h顆粒細(xì)胞層的大部分死亡細(xì)胞是不成熟的顆粒神經(jīng)元。創(chuàng)傷性腦損傷7d后,顆粒細(xì)胞層的FJB-陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量明顯減少(圖3 g和j),研究結(jié)果支持此結(jié)論,即齒狀回細(xì)胞死亡主要發(fā)

25、生在創(chuàng)傷性腦損傷后24h內(nèi),且創(chuàng)傷性損傷后24h后急劇減小。更高分辨率的圖像(圖3h)和三維重建圖像(圖3k)表明:大多數(shù)FJB-陽(yáng)性細(xì)胞都不與NeuN共存,而是與NCAM陽(yáng)性細(xì)胞共存。
　　 4.中度TBI后海馬細(xì)胞的死亡類型主要是壞死。我們?cè)趯?duì)側(cè)海馬沒(méi)有觀察到顯著的RIP-1表達(dá)(圖6 a,c,e),然而,在同側(cè)的海馬區(qū)的FJB-陽(yáng)性顆粒細(xì)胞有顯著的RIP-1表達(dá)(圖6b,d,f),合并后的圖像顯示,FJB-陽(yáng)性細(xì)胞(圖6b

26、)與RIP-1信號(hào)同時(shí)存在(圖6 f),用三維重建技術(shù)和高倍放大的圖像可見(jiàn)FJB-陽(yáng)性細(xì)胞高度表達(dá)的RIP-1(圖6g-j)。定量分析表明,在FJB-陽(yáng)性細(xì)胞中,有78.6±5.1％的細(xì)胞同時(shí)表達(dá)了RIP-1,這意味著有高比例的細(xì)胞死于壞死死亡,這些結(jié)果可作為創(chuàng)傷性腦損傷后海馬內(nèi)未成熟神經(jīng)元壞死死亡的支持證據(jù)。在CA1區(qū)觀察到大量裂解的活性caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞(補(bǔ)充圖A)。我們?cè)陬w粒細(xì)胞層沒(méi)有觀察到任何TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞(補(bǔ)充圖B

27、),但是,在同一個(gè)切片大腦皮層上有相當(dāng)數(shù)量的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞,相反,同樣作為陽(yáng)性對(duì)照,抗酶前處理的腦切片顯示在海馬和大腦皮層上有大量的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞(補(bǔ)充圖),我們進(jìn)一步考察了HDG的FJB-陽(yáng)性細(xì)胞和胞核的形態(tài),發(fā)現(xiàn)它們中大部分表現(xiàn)為細(xì)胞核輕微固縮但沒(méi)有明顯碎裂(圖5)。
　　 以上研究表明:繼發(fā)性細(xì)胞死亡主要發(fā)生在中度TBI后24h內(nèi)。為進(jìn)一步確定這一分布形式是發(fā)生在創(chuàng)傷性腦損傷后24h內(nèi)或在24h后繼續(xù)保持一致?我們

28、研究了損傷3d后的細(xì)胞死亡及其分布,中度的可控性大腦皮層創(chuàng)傷性損傷后,海馬繼發(fā)性死亡主要發(fā)生在顆粒細(xì)胞層。假手術(shù)組和空白對(duì)照組未見(jiàn)明顯的死亡陽(yáng)性細(xì)胞；TBI后海馬齒狀回內(nèi)的細(xì)胞死亡發(fā)生非常迅速,超過(guò)80％齒狀回顆粒細(xì)胞層(GCL)的細(xì)胞死亡發(fā)生在中度。TBI后的24h內(nèi),齒狀回顆粒細(xì)胞層(GCL)神經(jīng)元死亡的時(shí)域分布表明,防止神經(jīng)細(xì)胞死亡最佳治療時(shí)間窗為損傷后4h,且不能遲于損傷后24h；不僅在TBI后的最初幾個(gè)小時(shí),甚至在TBI后數(shù)天

29、當(dāng)細(xì)胞死亡率減小后,未成熟的神經(jīng)元對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷的耐受性仍是高度脆弱的,在創(chuàng)傷性腦損傷7d后,顆粒細(xì)胞層死亡細(xì)胞中大多是未成熟顆粒神經(jīng)元,只有一小部分是成熟的顆粒神經(jīng)元；顆粒細(xì)胞層中沒(méi)有檢出細(xì)胞凋亡,顆粒細(xì)胞層不成熟神經(jīng)元可能不是死于細(xì)胞凋亡。
　　 綜上所述:TBI后海馬實(shí)驗(yàn)小鼠經(jīng)一段時(shí)間(4h,24h,48h,3d,7d和14d),發(fā)現(xiàn)4h最多新生細(xì)胞死亡,繼發(fā)性細(xì)胞死亡主要發(fā)生在中度TBI后24h內(nèi),隨時(shí)間延長(zhǎng)有不同程度的

30、新生和成熟細(xì)胞死亡。提示臨床病人可以爭(zhēng)取寶貴的搶救時(shí)間,有效地預(yù)防和控制海馬細(xì)胞死亡,保護(hù)其生理功能。
　　 創(chuàng)傷性腦損傷后,新生神經(jīng)元是隨著時(shí)間的推移繼續(xù)死亡,還是在創(chuàng)傷性腦損傷后期,細(xì)胞死亡會(huì)從新生神經(jīng)元死亡轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒旒?xì)胞死亡有待研究。為此,我們通過(guò)組合使用針對(duì)成熟神經(jīng)元和不成熟神經(jīng)元的不同抗體的FJB染色和免疫染色,對(duì)顆粒細(xì)胞層中受影響的神經(jīng)元類型進(jìn)行了進(jìn)一步評(píng)估,創(chuàng)傷性腦損傷后用NeuN針對(duì)成熟的神經(jīng)元,用NCAM針對(duì)未

31、成熟的神經(jīng)元分別染色2周。按照NCAM/FJB與NeuN/FJB共存比計(jì)算,在損傷后的整個(gè)急性期(4h)和亞急性期(7d)未成熟神經(jīng)元與成熟退化神經(jīng)元恒定的較高比例表明,未成熟的神經(jīng)元是對(duì)海馬內(nèi)創(chuàng)傷性腦損傷耐受性差的主要神經(jīng)元群。這些定量的結(jié)果證實(shí)了我們以前的研究結(jié)果,結(jié)果也表明不成熟的神經(jīng)元值得作為一個(gè)可能的治療靶點(diǎn)予以重視。為什么不成熟的神經(jīng)元對(duì)創(chuàng)傷性腦外傷的耐受性如此脆弱仍未知。最近有關(guān)齒狀回新生神經(jīng)元的發(fā)育期間電生理特性的研究表

32、明,新生神經(jīng)元在電生理上與齒狀回顆粒細(xì)胞成熟的不同。由于其獨(dú)特的離子通道表達(dá),新生未成熟神經(jīng)元比成熟神經(jīng)元更容易被激活。分析這些電生理特征得出:這些新生神經(jīng)元對(duì)由創(chuàng)傷性腦損傷后受損神經(jīng)元釋放的神經(jīng)遞質(zhì)夸張興奮反應(yīng)將是有意義的。
　　 分子生物學(xué)技術(shù)作為一項(xiàng)新技術(shù)為腦損傷研究注入活力,開(kāi)辟了新的研究領(lǐng)域,但創(chuàng)傷性腦損傷后繼發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞損害的分子生物學(xué)機(jī)制研究剛剛起步,尚未得出肯定結(jié)論。有關(guān)腦損傷的基因治療仍處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究階段,尚