1、創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic Brain Injury TBI)致死、致殘率高，嚴(yán)重威脅人類的生命與生存質(zhì)量。顱腦損傷后藥物治療的匱乏始終是大家關(guān)注的焦點。到目前為止，已經(jīng)完成和即將完成的數(shù)百種藥物治療顱腦損傷的臨床多中心隨機雙盲研究的結(jié)果表明，還沒有一種藥物具有確切的臨床療效。而最近的大量動物實驗研究表明促紅細(xì)胞生成素(erythrooietin，EPO)對顱腦損傷有一定的療效。研究表明rhEPO對腦、脊髓在缺血后再灌注及低氧環(huán)境

2、中神經(jīng)的保護及損傷后修復(fù)等研究逐漸引起了人們的興趣。而rhEPO是否對重型顱腦損傷有神經(jīng)保護作用，無深入研究及報道。 本研究擬采用Feeney氏法制備重型顱腦損傷模型來評價rhEPO的神經(jīng)保護作用。首先觀察大鼠重型顱腦損傷后EPO及EPOR的變化規(guī)律，尋找外源性rhEPO治療顱腦創(chuàng)傷的理論依據(jù)。然后給予外源性rhEPO治療，觀察rhEPO對大鼠重型顱腦損傷后神經(jīng)功能及腦水腫的改善和凋亡相關(guān)蛋白表達的影響，從行為學(xué)，形態(tài)學(xué)和分子生

3、物學(xué)等多方面探討EPO腦保護作用的機制，為進一步研究EPO在顱腦創(chuàng)傷中的神經(jīng)保護作用尋找理論依據(jù)。 一、促紅細(xì)胞生成素及其受體在腦外傷后的表達及意義 目的：觀察促紅細(xì)胞生成素及受體在急性重型腦外傷后大腦皮質(zhì)內(nèi)的動態(tài)表達規(guī)律，并探討其意義。 方法：采用改良的Feeney氏法建立腦外傷模型，采用RT-PCR、westernblot及免疫熒光法檢測促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)及受體(eryth

4、ropoietin receptor，EPOR)的mRNA及蛋白的動態(tài)表達。 結(jié)果：EPO在傷后12h表達升高，至3d達高峰，5d降至正常水平。而EPOR在傷后12h表達升高，至24h達高峰，3d、5d和7d仍維持在高表達水平，未見減弱。 結(jié)論：大鼠急性重型顱腦損傷后大腦皮質(zhì)內(nèi)EPO短暫升高，而EPOR持續(xù)高表達且呈時間依賴性，提示顱腦損傷后外源性EPO能與持續(xù)高表達的EPOR結(jié)合產(chǎn)生神經(jīng)保護作用。 二、rhEP

5、O促進顱腦創(chuàng)傷大鼠神經(jīng)功能障礙改善的實驗研究 目的：探討促紅細(xì)胞生成素對大鼠重型顱腦損傷后神經(jīng)功能及腦含水量的影響，旨在研究其對重型顱腦損傷是否有神經(jīng)保護作用。 方法：將78只Wistar大鼠隨機分為3組：rhEPO治療組，腦損傷組，假手術(shù)組。72只采用改良的Feeney氏法制作重型腦損傷模型。rhEPO組大鼠致傷后即刻及每天腹腔內(nèi)注rhEPO(5000IU/kg)，外傷組給予等量生理鹽水。假手術(shù)組只行開顱手術(shù)操作，余步

6、驟同前；假手術(shù)組經(jīng)腹腔注射等量的生理鹽水。在傷后5h、12h、24h、3d、5d、7d六個時間點斷頭取腦。采用NSS神經(jīng)功能評分法，評定大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)情況；采用干濕重法測量腦含水量，根據(jù)公式腦含水量=(濕重-干重)/濕重×100％，算出腦含水量。HE及NISS染色觀察損傷周邊區(qū)病理改變及神經(jīng)細(xì)胞壞死情況。 結(jié)果：損傷組NSS評分為1d：15.17±2.15；3d：16.01±1.54；7d：12.69±1.60；rhEPO組為

7、1d：14.28±1.56；3d：12.42±1.37；7d：6.29±1.25。rhEP治療組與損傷組有顯著性差異(P＜0.05)。假手術(shù)組未見神經(jīng)功能受損。重型顱腦損傷后3 d損傷組腦含水量為85.58±0.36，rhEPO組為79.57±0.67。rhEPO組與損傷組相比腦水腫有顯著性差異(P＜0.05)。HE染色：腦損傷組傷后5 h損傷灶中心區(qū)大量神經(jīng)元消失，出現(xiàn)較多的紅細(xì)胞，伴輕度細(xì)胞水腫：傷后24h出現(xiàn)明顯的壞死，病灶中心區(qū)

8、神經(jīng)細(xì)胞脫失更明顯，范圍較5h增大，神經(jīng)細(xì)胞水腫，炎性細(xì)胞浸潤；傷后7d見膠質(zhì)細(xì)胞增生。rhEPO組與損傷組比較，壞死區(qū)縮小，神經(jīng)元受損及腦水腫減輕。膠質(zhì)細(xì)胞增生減輕。 結(jié)論：rhEPO能明顯改善大鼠重型顱腦損傷后神經(jīng)功能癥狀，減輕損傷周邊區(qū)腦水腫；初步證實了rhEPO對重型顱腦損傷后腦損傷有明顯的神經(jīng)保護作用。 三、促紅細(xì)胞生成素對大鼠重型顱腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax表達的影響 目的：

9、通過觀察rhEPO對大鼠重型顱腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax表達的影響，探討rhEPO是否能有效地抑制繼發(fā)性顱腦損傷，抑制神經(jīng)元的凋亡。 方法：實驗動物分組、模型制備及用藥同第二部分。RT-PCR，Westernblot免疫熒光法檢測Bcl-2、Bax基因及蛋白表達情況。細(xì)胞凋亡原位末端標(biāo)記(TUNEL)法觀察神經(jīng)元凋亡情況。 結(jié)果：①腦損傷組Bcl-2mRNA在外傷后5h弱表達，12h表達增強，2

10、4h達高峰，3d降至基礎(chǔ)水平；rhEPO組Bcl-2 mRNA在12h達高峰，24h、3d持續(xù)高表達；5d、7d表達下調(diào)但仍高于對照組(P＜0.05)。②Bcl-2蛋白主要分布在胞漿/胞膜內(nèi)，在外傷組24h表達增加，3d恢復(fù)到基礎(chǔ)水平；rhEPO組Bcl-2蛋白在24h達高峰，3d，5d，7d持續(xù)高表達(P＜0.05)。③Bax表達：腦損傷組在傷后12h可見Bax蛋白表達，傷后24小時增加緩慢；傷后72h其數(shù)量顯著增加，持續(xù)高表達一周，

11、而rhEPO治療組在傷后12h，24h和72h的Bax蛋白表達量與外傷組相比均顯著降低(P＜0.05)。假手術(shù)組未見明顯bax表達。④Tunel染色：Tunel染色陽性細(xì)胞于外傷后5h即已出現(xiàn)，3d達高峰，7d仍有表達；損傷組3d和7d凋亡細(xì)胞數(shù)分別為68±7.51和64±5.75；rhEPO組凋亡細(xì)胞數(shù)分別為32±5.48±106和29±6.51與腦損傷組相比均有顯著性差異(P＜0.05)。假手術(shù)組未見細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡。 結(jié)