1、木聚糖是谷物類飼料中一種主要的抗營養(yǎng)因子，通常需要添加內切木聚糖酶(EC3.2.1.8)破壞木聚糖長鏈結構，釋放出短鏈木寡糖，在木糖苷酶(EC3.2.1.37)的協(xié)同作用下，木聚糖可最終被水解成木糖。近年來，內切木聚糖酶已被廣泛應用于飼料、食品和制漿造紙工業(yè)等，此外以木糖為底物生產燃料乙醇的研究也具有廣闊前景。然而，目前木聚糖酶仍存在酶的催化活性不高、酶學特性不能滿足工業(yè)加工或生產應用的需求或酶的生產成本較高等不足，亟需開發(fā)兼具高活性且

2、酶學特性優(yōu)良的理想木聚糖酶基因及其高效表達宿主。本研究克隆了糖苷水解酶家族11的4種內切木聚糖酶基因和1種木糖苷酶基因，以其中的優(yōu)良基因為基礎對其進行分子改良，構建了相應的高拷貝重組酵母表達宿主，在搖瓶中發(fā)酵表達內切木聚糖酶和木糖苷酶，并對底物形態(tài)和水解特性進行分析。主要結果如下:
　　 1內切木聚糖酶與木糖苷酶基因的克隆及原核表達
　　 本研究克隆了家族11黑曲霉(Aspergillus niger xylanase，

3、anx)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis xylanase，bsx)、褐色高溫單孢菌（Thermomonospora fuscaxylanse，tfx）和雜合內切木聚糖酶(hybrid xylanse，atx)基因以及枯草芽孢桿菌來源的木糖苷酶(B.subtilis xylosidase，xylo)基因，并在大腸桿菌中進行表達。酶學特性分析發(fā)現(xiàn)，所有木聚糖酶均在酸性條件下較為穩(wěn)定。其中，ATx和Tfx兼具高酶活性和良好

4、的熱穩(wěn)定性，且Tfx具備良好的抗抑制劑特性和一個家族11木聚糖酶少有的碳水化合物結合域(carbohydrate binding module，CBM)。因此，atx和tfx可作為后續(xù)分子改良的基因材料。
　　 2 atx的分子改良及重組酵母菌的構建
　　 基于非理性設計思路，采用定向進化提高atx的催化活性。定向進化策略包括易錯PCR(error-prone PCR，EP-PCR)產生隨機突變，在微孔板上篩選木聚糖酶活

5、性提高的優(yōu)勢突變體。一輪EP-PCR后共篩選1530個轉化子得到一個酶活性提高的突變體基因FSI-A124。將atx和FSI-A124分別轉化畢赤酵母(Pichiapastoris) GS115，在PGAp啟動子和α交配因子信號肽的控制下分泌表達木聚糖酶，96 h發(fā)酵上清液中比活性分別為954和1556 U/mg。突變酶YFSI-A124的Km為4.25 mg/ml，較之野生酶YATx下降4.7％，催化轉化數(shù)kcat則提高44％。然而，

6、酶學特性分析顯示，YFSI-A124熱穩(wěn)定性略有下降。氨基酸比對和三維結構分析發(fā)現(xiàn)，L49P替換使得酶的催化區(qū)域變得柔和，突變酶與底物木聚糖的親和能力增強，酶的催化效率提升，另一方面氫鍵作用、相鄰氨基酸之間的范德華力和表面疏水作用減弱，導致酶的熱穩(wěn)定性下降。
　　 3tfx的分子改良
　　 綜合非理性設計和理性設計的優(yōu)勢，采用定向進化和定點突變相結合的技術，提高tfx的催化活性和熱穩(wěn)定性。首先利用兩輪EP-PCR隨機突變

7、，經(jīng)微孔板篩選約7000個突變體，獲得6個木聚糖酶活性提高的優(yōu)勢突變體。并對其中4處可能與酶的催化活性或熱穩(wěn)定性相關的氨基酸殘基進行序列飽和突變。將優(yōu)勢突變體用于DNA shuffling和StEP進行優(yōu)勢重組，經(jīng)篩選3000個轉化子共獲得3個木聚糖酶活性提高的優(yōu)勢突變體。之后，將S144C點突變引入G3DS2，使分子內產生一個新的二硫鍵，獲得兼具高活性和良好熱穩(wěn)定性的突變基因G4SM1(S62T/S144C/N198D/A217V)。

8、G4SM1的特異性比活為2036±45.8 U/mg，是野生酶Tfx的2.12倍，而Km值為1.84 mg/ml，較之野生酶顯著下降(P＜0.05)，而kcat/Km提高76％，提示酶與底物的親和能力增強，且酶的催化效率提高。三維結構分析顯示，推測位于催化區(qū)的兩處氨基酸替換S62T和S144C有助于提高酶的催化活性和穩(wěn)定性。
　　 4構建包含高拷貝G4SM1基因的重組酵母菌
　　 采用兩種不同的方法構建包含高拷貝G4SM

9、1及其催化區(qū)G4SM1_CBM基因的重組酵母。一是采用高濃度抗生素壓力法篩選酵母轉化子，將電擊后的轉化子分別涂布于含500、1000、1500和2000μg/mlzeocin的YPD平板，在1500和2000μg/mlzeocin的平板上挑取陽性轉化子進行拷貝數(shù)鑒定，Southern blot和qPCR分析顯示，28號菌株為包含兩拷貝G4SM1的重組酵母菌，命名為33-1。研究發(fā)現(xiàn)，Tfx中包含一段沒有催化活性的CBM2，為了減少高拷貝

10、外源基因對宿主的壓力，將Tfx中不影響其其催化活性的CBM2截去，采用一對同尾酶BamHⅠ和BgⅡ將表達盒頭尾相連，構建一個包含四拷貝表達盒的穿梭載體pGAPZαA/G4SM1_CBM(4)，再將該載體轉化P.pastoris SMD1168獲得包含四拷貝G4SM1_CBM基因的重組酵母33-2，Southern blot和qPCR進一步驗證其正確性。
　　 5共表達內切木聚糖酶和木糖苷酶的重組酵母菌的構建及搖瓶發(fā)酵、底物形態(tài)和

11、水解特性分析
　　 利用BamHⅠ和BglⅡ將pGAPZαA/G4SM1_CBM(4)與包含木糖苷酶基因的pPI CZαA/xylo相連接，獲得共表達內切木聚糖酶和木糖苷酶的重組載體pαAX-GAPGC(4)，轉化P.pastoris SMD1168獲得共表達宿主33-3。將菌株33-1和33-2在YPD培養(yǎng)基中分泌表達內切木聚糖酶，培養(yǎng)120 h后發(fā)酵上清液中總蛋白含量分別為0.49 g/l和0.65 g/1。菌株33-3能在

12、YPD培養(yǎng)基中僅表達內切木聚糖酶，同時也能在甲醇的誘導下共表達內切木聚糖酶和木糖苷酶，120 h發(fā)酵上清液中總蛋白含量達1.22 g/l。底物形態(tài)和水解特性分析顯示，未處理的樺木木聚糖結構致密、表面粗糙，多糖分子粘連程度高，經(jīng)內切木聚糖酶水解后，長鏈結構被破壞，分子呈現(xiàn)較小的顆粒狀態(tài)，表面形態(tài)趨于平整。水解24 h后，木二糖和木三糖的濃度分別為0.954±0.093 mg/ml和0.360±0.022 mg/ml，分別占總水解產物的62