1、食品添加劑廣泛應(yīng)用在食品生產(chǎn)加工的各個環(huán)節(jié)中，而作為一類天然或合成的化合物，其安全性也一直被人們普遍關(guān)注。國家食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)GB2760-2014核準(zhǔn)使用的食品添加劑都是經(jīng)過了系統(tǒng)毒理學(xué)安全性分析和危害風(fēng)險評估才被允許使用的，按規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)使用量添加即能保障食品安全。目前，國家食品添加劑安全評估標(biāo)準(zhǔn)是基于單一食品添加劑的毒性效應(yīng)建立起來的，而現(xiàn)實生活中一種食品常常包含兩種及以上食品添加劑聯(lián)合使用，且人們每天攝入的食品種類繁多，單一食品添

2、加劑在規(guī)定的使用范圍內(nèi)是安全的，而多種食品添加劑同時使用時可能產(chǎn)生相加、協(xié)同、拮抗等聯(lián)合作用，這就對傳統(tǒng)食品毒理學(xué)理論及食品添加劑的危害風(fēng)險評估提出了新的挑戰(zhàn)。
　　本論文采用HepG2細胞株，使用CCK-8法檢測通常在食品中大量使用的防腐劑亞硫酸鈉、焦亞硫酸鈉及偶氮類人工合成色素日落黃、誘惑紅、檸檬黃、赤蘚紅、胭脂紅對細胞增殖活力的影響，從中選出對細胞抑制能力較大的日落黃及亞硫酸鈉進行后續(xù)聯(lián)合試驗的研究;然后用CCK-8法及2×

3、2析因設(shè)計方差分析模型對細胞增殖活力指標(biāo)進行聯(lián)合評價，高內(nèi)涵分析(HCA)技術(shù)按效應(yīng)相加模型進行單獨及聯(lián)合作用的多參數(shù)細胞毒性（細胞數(shù)量、膜通透性、活性氧釋放量、死活比率、DNA損傷）研究;同時選取防腐劑山梨酸鉀及抗氧化劑D-異抗壞血酸鈉進行平行驗證試驗。
　　接著運用HCA對日落黃與亞硫酸鈉、山梨酸鉀與D-異抗壞血酸鈉單獨及聯(lián)合作用的多參數(shù)細胞凋亡指標(biāo)（Caspase-3/7、鈣離子濃度、線粒體膜電位）和細胞周期進行研究，對其誘

4、發(fā)的凋亡機制進行初步分析。
　　最后運用實時熒光定量PCR和Western印跡法對日落黃與亞硫酸鈉、山梨酸鉀與D-異抗壞血酸鈉單獨及聯(lián)合作用后細胞的Caspase-3、Bax、Bcl-2、p53、Caspase-12基因與蛋白的表達量進行分析進一步確定凋亡的通路。
　　通過上述試驗對食品添加劑單獨及聯(lián)合作用的相關(guān)生物學(xué)指標(biāo)進行分析，研究其聯(lián)合作用方式，并對作用機理進行探索;為食品添加劑的使用標(biāo)準(zhǔn)制定提供參考依據(jù)，主要結(jié)果及結(jié)

5、論如下:
　　幾種食品添加劑單獨作用均呈劑量相關(guān)性的抑制HepG2細胞增殖，抑制能力大小為:亞硫酸鈉＞焦亞硫酸鈉，日落黃＞胭脂紅＞檸檬黃＞誘惑紅＞赤蘚紅，其中亞硫酸鈉及日落黃作用24 h的IC50大小分別為1.06±0.07 g/L和0.30±0.02 g/L;山梨酸鉀及D-異抗壞血酸鈉均呈時間及劑量正相關(guān)抑制增殖，其24 h的IC50大小分別為1.35±0.11 g/L和1.58±0.17 g/L，按照析因方差設(shè)計分析聯(lián)合作用類

6、型表現(xiàn)為協(xié)同作用。
　　日落黃與亞硫酸鈉、山梨酸鉀與D-異抗壞血酸鈉單獨及聯(lián)合使用均會顯著減少細胞數(shù)量，并且增加細胞膜通透性、死活比率及活性氧的釋放量，均表現(xiàn)出劑量相關(guān)性;與單獨組相比，按照效應(yīng)相加模型評價均表現(xiàn)為協(xié)同作用。低、中劑量的處理組均未發(fā)現(xiàn)DNA損傷現(xiàn)象。
　　日落黃與亞硫酸鈉、山梨酸鉀與D-異抗壞血酸鈉單獨及聯(lián)合使用會導(dǎo)致HepG2細胞中Caspase-3/7蛋白及鈣離子濃度顯著上升，線粒體膜電位顯著下降，三種指

7、標(biāo)均呈現(xiàn)劑量相關(guān)性，聯(lián)合作用類型表現(xiàn)為協(xié)同;并且還發(fā)現(xiàn)這幾種化合物都誘導(dǎo)HepG2細胞發(fā)生了細胞周期阻滯，不同劑量誘導(dǎo)產(chǎn)生不同的周期阻滯，單獨組主要將周期阻滯在G0/G1和S期;聯(lián)合組則表現(xiàn)為G0/G1期阻滯。
　　實時熒光定量PCR和Western印跡法檢測結(jié)果顯示日落黃與亞硫酸鈉、山梨酸鉀與D-異抗壞血酸鈉單獨及聯(lián)合使用時均可通過顯著提高Caspase-3、Bax、P53基因的表達，同時顯著降低Bcl-2的表達來誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生