1、背景：
　　 內(nèi)皮廣泛存在于人體各級動(dòng)、靜脈及毛細(xì)血管內(nèi)膜表層，對維持血管的正常功能起著重要的作用。從胚胎時(shí)期的血管發(fā)生形成原始血管網(wǎng)到成年后的生理狀態(tài)下的血管內(nèi)皮代謝及病理狀態(tài)下的血管內(nèi)皮修復(fù)，內(nèi)皮細(xì)胞的作用貫穿于這一系列生理、病理過程的始終。內(nèi)皮細(xì)胞的損傷及功能紊亂導(dǎo)致了心、腦、腎等重要臟器血管性疾病的發(fā)生、發(fā)展，并與其預(yù)后直接相關(guān)。
　　 內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelialprogenitorcellsEPCs)作

2、為內(nèi)皮細(xì)胞的前體，最早由Asahara等發(fā)現(xiàn)，并于2002年定義為一種陽性表達(dá)CD34、CD133、VEGFR2，且可與荊豆凝集素(UEA-1)和乙?；兔芏戎鞍?acLDL)特異性結(jié)合的具有部分內(nèi)皮功能和分化能力的單個(gè)核細(xì)胞群。內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)來源于骨髓，存在于體循環(huán)中，它既能循環(huán)、增殖、遷移、分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞參與血管再生，也能夠結(jié)合在血管內(nèi)皮層，刺激鄰近內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。許多內(nèi)皮祖細(xì)胞激動(dòng)劑，如粒細(xì)胞集落刺激因子，血管內(nèi)皮

3、生長因子和他汀類藥物，已被證實(shí)可以激活內(nèi)皮祖細(xì)胞，然而這些EPC激動(dòng)劑的各種不良反應(yīng)，如血管通透性增加、再狹窄率升高以及嚴(yán)重的肝功能損害等，嚴(yán)重限制了它們在臨床治療中的應(yīng)用。
　　 熟地黃是一種沿用千年的傳統(tǒng)中藥，味甜、甘，性溫。歸肝經(jīng)、腎經(jīng)，有補(bǔ)血滋潤、益精填髓之功效?？捎糜谥委熝撐S、眩暈心悸、月經(jīng)不調(diào)、崩不止，肝腎陰虧、潮熱盜汗、遺精陽痿、不育不孕，腰膝酸軟、耳鳴耳聾、頭目昏花、須發(fā)早白，消渴、便秘、腎虛喘促等癥。在現(xiàn)代

4、醫(yī)學(xué)研究中，熟地黃提取物(RehmanniaglutinosaextractRGE)被證實(shí)可以促進(jìn)造血干細(xì)胞的增殖、分化，并促進(jìn)骨髓DNA含量的增加。由此，我們假設(shè):在生理狀態(tài)下，熟地提取物RGE是否可作用于內(nèi)皮祖細(xì)胞，從而達(dá)到其“補(bǔ)骨填髓”之功效。
　　 目的：
　　 1、掌握熟地提取物灌胃全身給藥方法，觀察不同濃度熟地提取物灌胃在不同時(shí)間點(diǎn)對生理狀態(tài)下大鼠循環(huán)和骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞作用變化
　　 2、篩選最佳給藥濃

5、度和作用時(shí)間，為后期實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)。探索內(nèi)皮祖細(xì)胞的體外分離、誘導(dǎo)培養(yǎng)、鑒定及功能檢測方法。
　　 方法：
　　 1、地黃提取物的制備
　　 熟地黃粗粉經(jīng)反復(fù)水溶、醇提得到地黃粗多糖，并以Sevag法去除蛋白純化為地黃多糖，并檢測其濃度、純度、提取率。
　　 2、實(shí)驗(yàn)分組
　　 80只雄性WISTAR大鼠隨機(jī)分為對照組(20只)，RGE低濃度組(20只，0.38g/kg·d)，RGE中濃度組(20只

6、，0.75g/kg·d)，RGE高濃度組(20只，1.5g/kg·d)。各組分別于3天、4周、8周、12周、16周取外周血，于4周、8周、12周、16周處死動(dòng)物取骨髓。
　　 3、內(nèi)皮祖細(xì)胞分離、培養(yǎng)
　　 取大鼠外周血及骨髓，用密度梯度法以淋巴細(xì)胞分離液Ficoll分離出單個(gè)核細(xì)胞，以4～5×107的細(xì)胞密度將單個(gè)核細(xì)胞平鋪于25cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，用加入了誘導(dǎo)因子的培養(yǎng)基EBM-2誘導(dǎo)培養(yǎng)。
　　 4、內(nèi)皮

7、祖細(xì)胞鑒定
　　 貼壁的細(xì)胞用DiL-acLDL和FITC-UEA-1標(biāo)記，DAPI染核，熒光共聚焦顯微鏡下觀察，DiL-acLDL和FITC-UEA-1雙表達(dá)的細(xì)胞記作EPCs。
　　 5、內(nèi)皮祖細(xì)胞計(jì)數(shù)
　　 分離出的單個(gè)核細(xì)胞與CD34、CD133、VEFFR2一抗分別孵育，后再與之相對應(yīng)的二抗:IgG-PerCP-Cy5.5、IgG-F(ab)2-PE、IgG-FITC孵育。流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞群中三種標(biāo)志

8、物陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)。
　　 6、內(nèi)皮祖細(xì)胞功能檢測
　　 (1)增殖功能檢測:MTT法檢測EPCs增殖能力。
　　 (2)遷移功能檢測:Transwell小室法檢測EPCs遷移能力。
　　 (3)成管功能檢測:Matrigel膠輔助下檢測EPCs管腔結(jié)構(gòu)的形成能力。
　　 7、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，所有數(shù)據(jù)用軟件SPSS11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

9、兩組間數(shù)據(jù)的比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，多組之間的比較用單因素方差分析。多組間的兩兩比較用費(fèi)希爾的LSD法。當(dāng)P＜0.05，認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)果：
　　 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一般情況
　　 80只雄性WISTAR大鼠，5～6周齡，體重在160～180克，普通飲食，正常晝夜節(jié)律，適應(yīng)性喂養(yǎng)3天，頸動(dòng)脈取外周血。經(jīng)口灌胃給藥，分為RGE低、中、高三個(gè)濃度組和對照組。每日每只大鼠灌胃藥物劑量為1ml，每周根據(jù)體重變化

10、調(diào)整給藥濃度，對照組每日生理鹽水1ml灌胃。各組大鼠健康狀況正常，試驗(yàn)中無自然死亡。
　　 2、流式細(xì)胞術(shù)分析內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量
　　 流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，與對照組相比，各藥物組外周血和骨髓EPCs數(shù)量隨灌藥時(shí)間的延長而增加。在外周血:8周末，中、高劑量組EPCs增加量較對照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01～0.05);12周末和16周末，三種劑量的RGE灌胃均使EPCs較對照組顯著增多(P＜0.01)，但各劑量組12至16

11、周的增長速率(8.53％、1.57％、1.79％)明顯低于8至12周的增長率(10.43％、12.84％、16.50％)。在骨髓:8周末，中、高劑量組EPCs數(shù)量較對照組有增加(P＜0.05);12周末和16周末，三種劑量的RGE灌胃均使EPCs較對照組顯著增多(P＜0.01)，各組8至12周增長速率為正(6.95％、12.10％、17.14％)然而12至16周增長速率明顯下降（高濃度組3.34％）或增長停滯（低、中濃度組）。
　

12、　 3、外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞功能檢測
　　 外周血分離單個(gè)核細(xì)胞，培養(yǎng)基EBM-2誘導(dǎo)培養(yǎng)48h換液，上清中的未貼壁細(xì)胞離心后重新加入，再經(jīng)過一個(gè)48h后棄去不貼壁細(xì)胞，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)48h。培養(yǎng)瓶內(nèi)的EPCs以胰酶消化并計(jì)數(shù)，備用功能檢測。
　　 (1)增殖功能檢測
　　 體外誘導(dǎo)培養(yǎng)6天的外周血EPCs用MTT法檢測細(xì)胞增殖能力。在16周末，中、高濃度組增殖能力與對照組相比有所升高(P＜0.05)，與各組4周末數(shù)

13、據(jù)相比亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。其余時(shí)間點(diǎn)各組增值能力無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 (2)遷移功能檢測
　　 Transwell小室法用于檢測體外培養(yǎng)6天的外周血EPCs的遷移能力。可見12周末，中、高濃度組可使遷移能力相較對照組和各組的4周末數(shù)據(jù)有所增高(P＜0.05)，但這種數(shù)量變化不明顯，且從12周末到16周末這種增殖能力沒有進(jìn)一步的增長。
　　 (3)成管功能檢測
　　 體外培養(yǎng)6天的外周血EPCs

14、平鋪于Matrigel膠預(yù)孵育的96孔板上，檢測EPCs管狀結(jié)構(gòu)形成能力。高濃度組在8周末相較于4周末城管能力有所增長(P＜0.05)，12周末成管能力的增高與對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。低、中、高濃度組在16周末成管能力相較于對照組均有顯著增高(P＜0.05)，與各組4周末數(shù)據(jù)相比較亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　 4、骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞功能檢測
　　 骨髓PBS懸濁液中分離單個(gè)核細(xì)胞，培養(yǎng)基EBM-2誘

15、導(dǎo)培養(yǎng)48h換液，傳代，與上清液中分離出的未貼壁細(xì)胞共培養(yǎng)，48h后換液，棄上清，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)4天。培養(yǎng)瓶內(nèi)的EPCs以胰酶消化并計(jì)數(shù)，備用功能檢測。
　　 (1)增殖功能檢測
　　 體外誘導(dǎo)培養(yǎng)6天的骨髓EPCs用MTT法檢測細(xì)胞增殖能力。在12周末，中、高濃度組增殖能力與對照組相比有所升高(P＜0.05)，與各組4周、8周末數(shù)據(jù)相比亦有所增加(P＜0.05)。16周末，這種增值能力的增長進(jìn)一步加劇(P＜0.01)。<

16、br>　　 (2)遷移功能檢測
　　 Transwell小室法用于檢測體外培養(yǎng)6天的骨髓EPCs的遷移能力。12周末和16周末，三種濃度的藥物刺激組遷移能力相較于對照組和各組4周末數(shù)據(jù)均有所增加(P＜0.05)，然而這種增長并不明顯。
　　 (3)成管功能檢測
　　 體外培養(yǎng)6天的骨髓EPCs平鋪于Matrigel膠預(yù)孵育的96孔板上，檢測其管狀結(jié)構(gòu)形成能力。12周末，中、高濃度組EPCs成管功能的增高與對照組

17、相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在16周末，這種相比對照組成管功能的增長更加明顯(P＜0.01～0.05)，且相對于各組4周末數(shù)據(jù)已有所增長(P＜0.01～0.05)。這種變化在高濃度組更加顯著(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1、在正常生理?xiàng)l件下，三種不同濃度的熟地提取物溶液灌胃喂養(yǎng)成年雄性大鼠，均可導(dǎo)致大鼠體內(nèi)EPCs數(shù)目的增多。相較于外周血來源的EPCs，骨髓來源EPCs的這種效應(yīng)更為明顯。且三種藥物濃度中

18、高濃度組作用較為突出，增長速率在灌胃后的12周左右達(dá)到最大。
　　 2、在生理?xiàng)l件下，RGE灌胃可活化大鼠外周血和骨髓中EPCs的功能。但這種活化作用在外周血EPCs中表現(xiàn)多不顯著。在骨髓中，EPCs的活化多發(fā)生于灌胃后的12周左右。
　　 第二部分、熟地提取物通過激活內(nèi)皮祖細(xì)胞對心梗模型大鼠缺血心肌的保護(hù)作用
　　 背景：
　　 心肌梗死(myocardialinfarction)是指在冠狀動(dòng)脈病變的基

19、礎(chǔ)上，冠狀動(dòng)脈的血流中斷，使相應(yīng)的心肌出現(xiàn)嚴(yán)重而持久地急性缺血，最終導(dǎo)致心肌的缺血性壞死。因此，血管再通及建立有效的側(cè)支循環(huán)是挽救缺血心肌，改善心肌梗死預(yù)后及降低死亡率的首要措施。越來越多的證據(jù)表明細(xì)胞移植和治療性血管再生是治療終末期冠狀動(dòng)脈疾病所致心肌梗死的最具潛力和研究意義的新方法。近年來的研究顯示:骨髓來源的干細(xì)胞分化形成的內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelialprogenitorcells，EPC)可在心梗后動(dòng)員、遷移、歸巢到損傷部

20、位，并促進(jìn)缺血區(qū)血管的新生，從而有效保護(hù)梗死后的心肌。近年來對熟地的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)作用研究顯示，熟地可有效促進(jìn)血細(xì)胞和骨髓增殖，治療心腦血管缺血性疾病。然而研究方法的陳舊、手段的單一、機(jī)制探討的膚淺限制了熟地在臨床上的推廣，且目前為止尚未有研究將熟地的作用機(jī)制與內(nèi)皮祖細(xì)胞相連。
　　 血管發(fā)生和血管生成是新血管形成的兩種基本形式。血管發(fā)生是指胚胎中的成血管細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞系分化包繞形成原始血管網(wǎng)并最終分化成熟形成心血管系統(tǒng);血管生成是指

21、從在原有血管網(wǎng)基礎(chǔ)上，通過內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖、伸展及管狀結(jié)構(gòu)形成等步驟最終長成新生毛細(xì)血管的復(fù)雜過程。成熟個(gè)體中的血管再生主要通過新毛細(xì)血管的生成得以實(shí)現(xiàn)。參與成熟個(gè)體中血管再生的細(xì)胞為內(nèi)皮祖細(xì)胞。因此內(nèi)皮祖細(xì)胞成為當(dāng)今醫(yī)療領(lǐng)域中治療缺血性疾病的研究焦點(diǎn)，尤其是在治療心肌梗死中成為新的治療靶點(diǎn)。生理狀態(tài)下，外周血中的EPCs數(shù)量較少，而骨髓中的EPCs多處于相對靜息狀態(tài);心梗發(fā)生后在急性期內(nèi)，骨髓中的EPCs被動(dòng)員到外周血中，活化并歸巢

22、到損傷部位，通過參與損傷部位血管的新生維持損傷部位的血供。
　　 我們由實(shí)驗(yàn)Ⅰ證實(shí)了熟地提取物在生理狀態(tài)下對內(nèi)皮祖細(xì)胞的動(dòng)員作用，由此我們做出推斷:熟地提取物是否可以動(dòng)員心梗條件下體內(nèi)的EPC從而達(dá)到保護(hù)受損心肌，治療心肌梗死的作用。本實(shí)驗(yàn)中我們針對這一假設(shè)展開實(shí)驗(yàn)。
　　 目的：
　　 1.建立大鼠心肌梗死模型，探討中藥熟地黃在心梗的急性期和慢性期對大鼠缺血心肌的保護(hù)作用。
　　 2.觀察心梗后大鼠外周

23、血和骨髓中內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量、功能變化，探討內(nèi)皮祖細(xì)胞在急性期和慢性期對心梗的治療作用，并觀察熟地對內(nèi)皮祖細(xì)胞這一作用的影響。
　　 方法:
　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　 120只雄性WISTAR大鼠(8周齡，體重180～200g)隨機(jī)分為兩組（每組60只）:空白組生理鹽水1ml/d灌胃，試驗(yàn)組熟地提取物生理鹽水溶液1.5g/kg·d灌胃。
　　 兩組分別灌胃8周后，每組又隨機(jī)分為對照組（16只，不手術(shù)），假手

24、術(shù)組（16只，手術(shù)開胸穿線不結(jié)扎），心梗組（28只，行冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎術(shù)）。至此實(shí)驗(yàn)大鼠分為6組:生理鹽水對照組(N-b，16只)、生理鹽水假手術(shù)組(N-m，16只)、生理鹽水心梗組(N-MI，28只)、熟地對照組（RGE-b，16只）、熟地假手術(shù)組（RGE-m，16只）、熟地心梗組(RGE-MI，28只)。
　　 術(shù)后繼續(xù)灌胃喂養(yǎng)4周，分別于術(shù)后第3天，1周末，2周末，4周末處死各組4～7只大鼠。
　　 2.心梗模型

25、的建立
　　 法一:大鼠用2.5％的戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔注射麻醉。仰臥位將大鼠固定在手術(shù)臺(tái)上，剪除胸部被毛。胸骨左側(cè)3～4肋間心尖搏動(dòng)最明顯處橫向剪開胸部皮膚約1.5～2cm，鈍性分離皮下組織、胸大肌、前鋸肌。順肋間肌紋理鈍性撐開3～4肋間，可見搏動(dòng)的心尖，在心尖以上0.5cm處快速穿過可吸收縫合線，閉合式結(jié)扎。對合前鋸肌、胸大肌，胸部皮膚縫合前輕擠壓縫合口排出胸腔氣體，縫合皮膚切口。皮下注射青霉素8萬IU/kg常規(guī)

26、抗感染。
　　 法二:乙醚吸入式麻醉大鼠，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，剪除頸部及胸部被毛?？v向剪開大鼠頸部皮膚約1.5～2cm，分離皮下組織及肌肉，鈍性分離氣管，于氣管環(huán)之間剪開氣管半周。行氣管插管，連接呼吸機(jī)，調(diào)整呼吸頻率、呼吸比和潮氣量。胸骨左緣3mm處縱向剪開皮膚約4cm，鈍性分離皮下組織、胸大肌、前鋸肌。于第三肋間剪開肋間肌暴露胸膜。撐開肋骨，于呼氣相刺破胸膜，暴露心臟。在肺動(dòng)脈圓錐與左心耳交界下方2mm處以可吸收縫合線結(jié)扎冠

27、狀動(dòng)脈前降支。逐層縫合肌肉和皮膚。大鼠蘇醒后拔除氣管插管，清理氣道血塊及分泌物。對合頸部肌肉及皮下組織，縫合皮膚切口。皮下注射青霉素8萬IU/kg常規(guī)抗感染。
　　 假手術(shù)組手術(shù)步驟同上，冠狀動(dòng)脈處穿過結(jié)扎線但不打結(jié)。
　　 3.存活率分析
　　 保留存活記錄并繪制生存曲線。
　　 4.心電圖及超聲心動(dòng)圖檢測
　　 所有大鼠于術(shù)前和術(shù)中進(jìn)行心電圖監(jiān)測，顯示即時(shí)心功能情況。大鼠于術(shù)前和心梗后3天、1

28、周、2周、4周，處死之前行經(jīng)壁超聲心動(dòng)圖檢測，B型超聲記錄心臟運(yùn)動(dòng)情況，M型超聲測量同一個(gè)心動(dòng)周期內(nèi)左室收縮末期和舒張末期的左室內(nèi)徑，系統(tǒng)計(jì)算左室收縮末期容積(LV-s)，左室舒張末期容積(LV-d)，左室相對質(zhì)量(LV-mass)，左室射血分?jǐn)?shù)(EF％)，左室短軸縮短率(FS％)，血流E峰、A峰比值(E/A)。
　　 5.血清學(xué)指標(biāo)檢測
　　 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血清中心肌損傷相關(guān)指標(biāo)Tn-T、BNP的含量

29、，反應(yīng)心肌損傷程度。
　　 6.外周血、骨髓中內(nèi)皮祖細(xì)胞量的測定
　　 外周血/骨髓細(xì)胞懸液經(jīng)紅細(xì)胞裂解后與CD34、CD133、VEFFR2抗體共孵育，后再與之相對應(yīng)的二抗:IgG-PerCP-Cy5.5、IgG-F(ab)2-PE、IgG-FITC共孵育。流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞群中三種標(biāo)志物陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)。
　　 7.體外培養(yǎng)的骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞功能測定
　　 (1)增殖功能檢測:MTT法檢測EPCs增殖能

30、力。
　　 (2)遷移功能檢測:Transwell小室法檢測EPCs遷移能力。
　　 (3)成管功能檢測:Matrigel膠輔助下的EPCs管腔結(jié)構(gòu)形成能力檢測。
　　 8.組織病理學(xué)染色
　　 留取大鼠心臟標(biāo)本，行蘇木素-伊紅染色(HE)，POLEY缺血染色，觀察心肌組織形狀，及各組心肌缺血情況。
　　 9.心肌細(xì)胞凋亡情況檢測
　　 TUNEL法檢測各組梗死區(qū)及其周邊區(qū)心肌細(xì)胞的凋亡情

31、況
　　 10.免疫組織化學(xué)染色
　　 免疫組織化學(xué)檢測梗死部分心肌血管新生情況，檢測新生毛細(xì)血管內(nèi)皮相關(guān)豐旨標(biāo)CD133、VEGFR2。
　　 11.實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-timePCR)檢測組織mRNA水平(
　　 )Real-timePCR檢測心肌組織內(nèi)血管新生相關(guān)指標(biāo)CD133、VEGFR2的表達(dá)水平。
　　 12.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x

32、)±s）表示，所有數(shù)據(jù)用軟件SPSS11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組數(shù)據(jù)間比較用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，多組之間的兩兩比較用單因素方差分析。多組間的兩兩比較用費(fèi)希爾的LSD法。當(dāng)P＜0.05，認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)果:
　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一般情況
　　 本研究共涉及雄性WISTAR大鼠120只，假手術(shù)32只，心梗手術(shù)56只。行心梗手術(shù)的大鼠當(dāng)天死亡5只，手術(shù)成功率為91％，心梗急性期3天內(nèi)死亡4只，急性期存活率為84

33、％，其后的試驗(yàn)中死于超聲麻醉意外的2只，不明原因死亡2只，總存活率為77％。假手術(shù)組術(shù)后急性期死亡2只，存活率為94％。
　　 2.心電圖及心臟超聲檢測結(jié)果
　　 大鼠于術(shù)前和術(shù)中進(jìn)行心電圖監(jiān)測，顯示結(jié)扎后ST段改變和病理性Q波的出現(xiàn)。大鼠術(shù)后超聲結(jié)果與術(shù)前相比較:左室收縮期內(nèi)徑(LV-s)、左室舒張期內(nèi)徑(LV-d)、左室相對質(zhì)量(LV-mass)升高，左室射血分?jǐn)?shù)(EF)、左室短軸縮短率(FS)下降，E/A倒置(P＜

34、0.01～0.05)。這些指標(biāo)的變化標(biāo)志著心梗模型的成功建立。
　　 超聲結(jié)果顯示:在大鼠心梗急性期（術(shù)后3天至術(shù)后1周），熟地組和生理鹽水組大鼠的左室射血分?jǐn)?shù)幾乎沒有差異;而在心梗的慢性期（術(shù)后2周至術(shù)后4周），與生理鹽水組相比熟地組可明顯改善心梗造成的EF、FS的降低(P＜0.05)。
　　 3.血清學(xué)檢測
　　 心梗術(shù)后血清中Tn-T和BNP含量與對照組和假手術(shù)組相比顯著升高(P＜0.01)亦證實(shí)了心梗模型

35、的成功建立。
　　 心梗后，熟地組血清Tn-T含量在術(shù)后1周末開始下降(P＜0.01～0.05)，而生理鹽水組則在術(shù)后4周末開始下降(P＜0.05)，證實(shí)熟地可在心梗后降低心肌損傷。
　　 心梗后，生理鹽水組血清中的BNP含量隨著時(shí)間延長呈上升趨勢(P＜0.01～0.05)，而在熟地組這種上升趨勢則不明顯。提示熟地干預(yù)可降低心梗后發(fā)生心肌細(xì)胞相關(guān)延時(shí)性損傷的風(fēng)險(xiǎn)。
　　 4.外周血和骨髓中EPCs含量的測定

36、>　　 心梗術(shù)后與術(shù)前相比，熟地組和生理鹽水外周血的EPCs含量均升高而骨髓中EPCs含量則降低(P＜0.01～0.05)，說明心梗發(fā)生后，心肌損傷導(dǎo)致骨髓中的EPCs被動(dòng)員到了外周血中。在心肌梗死發(fā)生后的慢性期（2周末和4周末），熟地組外周血EPCs的增長幅度大于生理鹽水組(P＜0.01)，而熟地組骨髓EPCs的降低不如生理鹽水組明顯(P＜0.01)，可見熟地可以增加動(dòng)員到外周血的EPCs數(shù)量同時(shí)保持骨髓中EPCs的儲(chǔ)備量。由此亦可

37、判斷，熟地作用于心梗大鼠，除了增加了EPCs動(dòng)員量以外，體內(nèi)EPCs總量也有所增加。
　　 5.骨髓EPCs功能的測定
　　 (1)增殖功能檢測:心肌的梗死使生理鹽水組和熟地組的EPCs增殖能力均有所上升(P＜0.01)，這種上升在生理鹽水組于術(shù)后2周開始下降(P＜0.05)，而在熟地組這種增殖能力則一直保持在較高水平?？梢娛斓乜纱龠M(jìn)心梗后EPCs的增值能力。
　　 (2)遷移功能檢測:心梗后生理鹽水組和熟地組的

38、EPCs遷移能力均有所增加(P＜0.01)，而在心梗術(shù)后4周，熟地組EPCs的遷移能力比生理鹽水組更加活躍(P＜0.05)。
　　 (3)成管功能檢測:從心梗術(shù)后2周熟地組EPCs參與成管的數(shù)量明顯多于生理鹽水組(P＜0.05)。在空白對照組，也有類似的情況發(fā)生。說明，熟地可強(qiáng)化心梗后EPCs的成管功能，亦能在生理狀態(tài)下激活這種功能。
　　 6.組織病理學(xué)染色檢測
　　 (1)HE染色顯示:術(shù)后1周開始，梗死心肌

39、組織發(fā)生明顯的組織形態(tài)學(xué)變化:梗死區(qū)肌纖維溶解、斷裂，排列紊亂。
　　 (2)POLEY缺血染色:缺血心肌染為紅色，而正常心肌組織為藍(lán)色。在心梗的急性期（術(shù)后3天到1周）熟地組和生理鹽水組差異不明顯;到心梗慢性期（術(shù)后2周到4周）熟地組缺血心肌的面積較之生理鹽水組下降明顯(P＜0.05)。
　　 7.心肌細(xì)胞凋亡檢測
　　 TUNEL染色法用于檢測心肌細(xì)胞凋亡情況。在心梗術(shù)后2周和4周，熟地組心肌細(xì)胞的凋亡量明顯

40、少于生理鹽水組。
　　 8.免疫組織化學(xué)檢測
　　 (1)心肌梗死后，在兩種干預(yù)（生理鹽水和熟地）下，VEGFR2在心肌組織中的表達(dá)均隨時(shí)間變化有所增加(P＜0.05～0.01)，而在心梗發(fā)生1周以后（熟地灌胃9周）開始，VEGFR2在熟地組中的表達(dá)逐漸高于在生理鹽水組中的表達(dá)(P＜0.05～0.01)。
　　 (2)心肌梗死后，在兩種干預(yù)（生理鹽水和熟地）下，CD133在心肌組織中的表達(dá)均隨時(shí)間變化有所增加(P

41、＜0.05～0.01)，而在心梗的慢性期(心梗術(shù)后2周到4周，CD133在熟地組中表達(dá)的增多明顯高于生理鹽水組(P＜0.01)。
　　 9.Real-timePCR檢測
　　 為了驗(yàn)證免疫組織化學(xué)中對VEGFR2、CD133表達(dá)量變化的檢測，我們用Real-timePCR在mRNA水平驗(yàn)證VEGFR2和CD133的表達(dá)量。結(jié)果顯示VEGFR2和CD133在mRNA水平的變化趨勢與免疫組織化學(xué)染色法中檢測到的它們在蛋白水平

42、的變化趨勢一致。
　　 結(jié)論:
　　 (1)熟地灌胃可降低心梗后心肌細(xì)胞的缺血壞死和凋亡，通過增加血管新生改善梗死心肌的血供，保護(hù)梗死后的心室功能，改善預(yù)后。
　　 (2)熟地灌胃可增加心肌梗死后骨髓動(dòng)員到外周血的EPCs數(shù)量，并保持EPCs的較高活性，促進(jìn)其參與管腔形成;于此同時(shí)，又可保持骨髓EPCs數(shù)量的相對穩(wěn)定。
　　 (3)與生理鹽水組相比，熟地的治療作用大多發(fā)生在心肌梗死的慢性恢復(fù)期，而非急性發(fā)