1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）是糧谷類食物重要的污染物之一，其在大麥、小麥、玉米以及其他谷類作物中含量最高，而農(nóng)副產(chǎn)品（如啤酒、面包、雞蛋、牛奶和肉類等）中也有檢出。DON是單端孢霉烯族化合物B型中的一員，該族化合物已被證實由食物與環(huán)境中的鐮刀菌、葡萄穗霉菌以及漆斑菌等在生長過程中產(chǎn)生，并且其引起的食物中毒事件一直是全球食品安全工作者關注的重點之一。DON很難被一般的烹調和加熱降解，即其毒性在一般情況下很難被

2、破壞，因此其在食品和環(huán)境中具有極高的殘留濃度，一旦形成將通過食物鏈的傳遞對人體和動物的健康產(chǎn)生巨大威脅。
　　就目前的研究來看，DON可在多個物種體內引起多器官的損傷，主要表現(xiàn)為惡心、嘔吐、拒食、腹瀉、消化紊亂以及體重減輕等相對較輕微的反應，也可引起皮膚損傷，免疫抑制甚至骨髓破壞等嚴重不良反應。從另一方面來說，DON在體內無特殊的靶器官，但具有很強的細胞毒性。同時DON具有多種生物毒作用，主要包括細胞毒性，免疫毒性，遺傳毒性，以及

3、致畸性和致癌性等。近年來在體內和體外模型上，DON被發(fā)現(xiàn)具有影響不同動物和細胞繁殖和胚胎發(fā)育的特征，豬和鼠是應用廣泛的體內實驗研究對象，而BeWo細胞和卵母細胞則是重要的體外實驗研究對象。雖然DON的胚胎發(fā)育毒性已被眾多研究所證實，但是其毒性作用機制仍需更深入的探討，而這一點將是本研究的重點之一。
　　早期的實驗已證實細胞內ROS過度堆積所引起的氧化應激是DON引起早期毒作用的重要機制之一。本研究將關注該毒作用機制是否存在于DON

4、誘導胎盤氧化損傷的模型中。胎盤（placenta）是母體與胎兒進行物質交換的器官，胎兒在子宮中僅能依靠胎盤從母體獲得營養(yǎng)。HO-1是血紅素代謝的關鍵酶，其表達上調對于細胞來說是自我保護的適應性機制之一，即一定程度上保護細胞免于各種因素引起的氧化損傷。就本實驗來說，一方面HO-1廣泛分布于全身（包括子宮和胎盤）組織細胞的微粒體內，能被多種刺激因素（如低氧狀態(tài)、內毒素及紫外線照射等）引起的氧化應激誘導表達，這是機體抵抗氧化損傷的重要機制之一

5、。另一方面HO-1的缺陷將導致多種妊娠不良結局的出現(xiàn)（如復發(fā)性流產(chǎn)、宮內發(fā)育遲緩、死胎和先兆子癇等）。因此，我們認為HO-1可作為本研究的效應標志物，同時探討其相關信號通路，即Nrf2/HO-1信號轉導通路，在該過程中的表達情況也是本研究的關注點之一。
　　綜上所述，本課題一方面可確證DON所致胚胎發(fā)育毒性，另一方面將深入分析DON引起胚胎發(fā)育毒性的分子機制。因此，該課題的完成將對DON發(fā)育毒性的早期預警和風險評估基礎資料的建立起

6、到不可或缺的作用。
　　第一部分妊娠期脫氧雪腐鐮刀菌烯醇暴露對C57BL/6小鼠胚胎毒性研究
　　目的：對妊娠期DON染毒C57BL/6小鼠在妊娠末期進行胚胎發(fā)育評價，確證DON具有胚胎毒性，同時初步分析DON致胚胎毒性的特點。
　　方法：小鼠適應性喂養(yǎng)1w后以2:1的比例將雌雄小鼠合籠，次日以查見陰栓者（查出精子）定為妊娠0.5 d（Gestation day0.5 d，GD0.5 d）。按體重將懷孕母鼠隨機分為4組

7、后在母鼠GD9.5-11.5 d分別給予不同劑量DON溶液連續(xù)灌胃染毒。具體分組情況如下：（1）陰性對照組（Control）：超純水；（2）DON低劑量組（DON-L）：1.0 mg/kg/day；（3）DON中劑量組（DON-M）：2.5 mg/kg/day；（4）DON高劑量組（DON-H）：5.0 mg/kg/day。GD18.5 d將母鼠頸椎脫臼處死，分離子宮觀察胎盤和胚胎。觀察外形的同時進行骨骼和內臟的染色以確定是否存在相應畸

8、形，同時計算與胚胎發(fā)育相關各指標的數(shù)值并進行統(tǒng)計分析。
　　結果：（1）妊娠期DON暴露對母鼠的影響：DON對妊娠期母鼠引起的拒食和體重減輕等作用不明顯。各組母鼠的胎窩總重，胎盤總重和平均胎盤重未出現(xiàn)顯著性差異（P>0.05）；
　?。?）妊娠期DON暴露對胚胎的影響：高劑量組的活胎率和吸收胎率與對照組相比具有顯著性差異（P<0.01），且高劑量組多只母鼠均出現(xiàn)全吸收胎的情況。DON對小鼠胚胎發(fā)育的影響可能并不表現(xiàn)在外觀和內

9、臟畸形方面，而是表現(xiàn)在骨骼畸形方面，且全身各處骨骼均可檢出明顯的畸形。
　　結論：（1）初步證實DON具有胚胎毒性，且GD9.5-11.5 d時5.0 mg/kg DON暴露主要導致吸收胎，而2.5 mg/kg DON暴露對胚胎的影響則主要表現(xiàn)為骨骼畸形，另外1.0 mg/kg DON對母鼠和胚胎的影響未被觀察到；
　?。?）DON暴露引起的骨骼畸形分布于全身，如頭頸部，中軸骨，鎖骨和四肢骨骼均可檢出明顯的畸形，而其中尾部畸

10、形（卷尾）的發(fā)生率最高。
　　第二部分妊娠期脫氧雪腐鐮刀菌烯醇暴露對C57BL/6小鼠胎盤氧化應激的影響
　　目的：觀察妊娠期DON暴露時胎盤氧化應激水平和Nrf2/HO-1信號轉導通路表達水平。探討DON誘導胎盤氧化應激在DON所致胚胎毒性中的角色，同時初步探討HO-1在此過程中所起作用。
　　方法：小鼠適應性喂養(yǎng)1w后以2:1的比例將雌雄小鼠合籠，次日以查見陰栓者（查出精子）定為GD0.5 d。按體重將懷孕母鼠隨機

11、分為4組后在母鼠GD9.5-11.5 d分別給予不同劑量DON溶液連續(xù)灌胃染毒。具體分組情況如下：（1）陰性對照組（Control）：超純水；（2）DON低劑量組（DON-L）：1.0 mg/kg/day；（3）DON中劑量組（DON-M）：2.5 mg/kg/day；（4）DON高劑量組（DON-H）：5.0 mg/kg/day。GD18.5 d將母鼠頸椎脫臼處死后進行后續(xù)實驗。將胎盤組織固定并進行H&E染色，檢測胎盤組織ROS水平的

12、同時對氧化和抗氧化指標（MDA，SOD，GSH）水平進行分析。此外，PCR和WB檢測信號轉導通路Nrf2/HO-1相關基因mRNA和蛋白表達水平的同時使用ELISA的方法測定胎盤組織中HO-1的酶水平。另外，采用激光共聚焦法來測定細胞中Nrf2的轉位。最后，初步探討炎癥和凋亡相關基因在此過程中的表達水平。
　　結果：（1）DON對胎盤的結構和功能均具有損傷作用，在中劑量和高劑量組尤為明顯；
　?。?）妊娠期DON暴露會引起胎

13、盤ROS聚集，該現(xiàn)象在DON劑量為5.0 mg/kg/day時較為明顯。高劑量組MDA水平顯著高于對照組（P<0.01）。低、中劑量組與對照組相比SOD水平顯著性上升（P<0.05），且具有劑量效應，而高劑量組未出現(xiàn)顯著性改變。然而，3個DON處理組與對照組相比GSH水平均無顯著性差異；
　?。?）3個DON處理組PIGF的mRNA表達水平均顯著性低于對照組（P<0.05），而以上3組的蛋白質水平雖均低于對照組，但僅高劑量組與對照

14、組相比差異具有顯著性（P<0.01）；
　?。?）3個DON處理組HO-1酶水平均低于對照組，但從低劑量組到高劑量組表現(xiàn)出上調趨勢，其中低劑量組和中劑量組與對照組相比差異具有顯著性（P<0.05）；
　　（5）HO-1的mRNA在低劑量組顯著性高于對照組（P<0.05），而高劑量組顯著性低于對照組（P<0.01），而Nrf2的mRNA在低劑量組和中劑量組均顯著性高于對照組（P<0.05）。HO-1的蛋白表達在中劑量組（P<0

15、.01）和高劑量組（P<0.05）均顯著性高于對照組，而Nrf2的蛋白表達在低劑量組（P<0.05）、中劑量組（P<0.05）和高劑量組（P<0.01）均顯著性高于對照組。Keap-1的蛋白表達未出現(xiàn)顯著性改變。同時在該過程中胎盤中Nrf2由細胞質向細胞核中轉位的現(xiàn)象可被觀察到；
　?。?）炎癥相關指標IL-6，IL-8，TNF-α和Cox-2的mRNA表達在3個DON處理組表現(xiàn)得頗為復雜，具體情況為低劑量組中發(fā)現(xiàn)TNF-α表達顯

16、著性上調（P<0.05），中劑量組Cox-2表達顯著性下調（P<0.05），而高劑量組則是IL-6顯著性下調（P<0.05）而IL-8顯著性上調（P<0.05）。
　　結論：（1）妊娠期母鼠DON暴露將對母鼠胎盤產(chǎn)生結構和功能上的雙重損傷；
　?。?）胎盤結構和功能的損傷可能與DON引起的胎盤氧化應激相關，炎癥和凋亡也在該過程中出現(xiàn)，但其具體變化情況仍需進一步研究；
　?。?）胎盤中Nrf2/HO-1信號轉導通路在DO

17、N發(fā)揮胚胎毒性過程中發(fā)生表達改變，并可能起到保護胎盤和胚胎發(fā)育的作用。
　　第三部分脫氧雪腐鐮刀菌烯醇染毒對BeWo細胞毒性分子機制研究
　　目的：對BeWo細胞給予不同劑量的DON染毒，同時結合HO-1激活劑（Hemin）和抑制劑（Znpp），探討DON染毒導致的氧化應激反應對該細胞的影響。另外，驗證HO-1在DON染毒時在BeWo細胞中表達的時間-和劑量-效應關系。
　　方法：復蘇細胞后在培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，每日觀察

18、細胞的生長和貼壁狀況，當細胞融合程度達到80％時即可進行細胞傳代。而后按實驗要求將細胞接種到所需器皿上（如12孔板，96孔板或培養(yǎng)皿等），接種后保持隔天換液。使用CCK-8試劑盒進行細胞活力檢測，確定具體的分組：（1）陰性對照組：0 nM DON；（2）DON處理組：50 nM DON；（3）HO-1激活劑組：50 nM DON+10μM Hemin；（4）HO-1抑制劑組：50 nM DON+10μM Znpp。按以上分組培養(yǎng)1 h（

19、僅PCR），3 h，12 h和24 h后進行后續(xù)實驗。使用ELISA試劑盒分別測定細胞分泌β-HCG的水平和HO-1的酶水平。多功能酶標儀被用來測定細胞內ROS水平，此外運用不同的試劑盒測定細胞中MDA, SOD和GSH水平。PCR檢測信號轉導通路Nrf2/HO-1相關基因mRNA的表達水平。另外，采用激光共聚焦法來測定細胞中Nrf2的轉位。最后，PCR初步分析炎癥和凋亡相關基因mRNA在此過程中的表達水平。
　　結果：（1）所有

20、DON處理組β-HCG水平均顯著性低于對照組（P<0.01），在3 h和12 h時HO-1激活劑和抑制劑組與50 nM DON處理組相比均無顯著性差異，而在24 h時以上兩組β-HCG水平均顯著性低于50 nM DON處理組（P<0.05）；
　?。?）DON處理時細胞發(fā)生顯著的ROS堆積（P<0.01），而HO-1激活劑能顯著性改善DON處理引起的ROS堆積（P<0.01）。3 h時HO-1激活劑和抑制劑組MDA水平均顯著性高于

21、DON處理組（P<0.01），但在12 h時HO-1激活劑組變?yōu)轱@著性低于DON處理組（P<0.05）。Hemin在3 h表現(xiàn)為升高SOD水平（P<0.05），但此后均顯著性下調SOD水平（P<0.01），而Znpp僅在12 h表現(xiàn)為顯著性上調其水平（P<0.01）。Hemin在3 h顯著性下調GSH水平（P<0.01），而Znpp則在24 h顯著性上調GSH水平（P<0.01）；
　?。?）3 h時Hemin和Znpp分別表現(xiàn)出

22、相應的上調和下調HO-1酶水平的作用（P<0.01），12 h時3個DON處理組無顯著性差異，24 h時Hemin和Znpp均表現(xiàn)為上調HO-1水平（P<0.01）；
　?。?）Hemin和Znpp在各時間點均升高HO-1的mRNA表達水平（P<0.01），Hemin僅上調3 h時Nrf2的表達（P<0.05），而Znpp上調12 h和24 h時Nrf2的mRNA表達（P<0.01）。此外，Hemin和Znpp預處理的BeWo細胞

23、在較長時間DON處理（如12 h和24 h）時，Nrf2將出現(xiàn)明顯的從細胞質向細胞核轉位的過程；
　?。?）隨著DON處理時間和劑量的增加，細胞炎癥反應不斷增強，各炎癥因子表達趨勢較為復雜。
　　結論：（1）早期DON處理時，HO-1激活劑改善DON導致的細胞功能障礙，而隨著時間的進展，HO-1激活劑的該功能逐漸失效，反而是HO-1抑制劑起到更有效的改善功效；
　?。?）ROS水平對DON染毒時的胎盤滋養(yǎng)層細胞中HO-