1、近年來，隨著細(xì)胞生物學(xué)的不斷發(fā)展，人們對(duì)細(xì)胞內(nèi)的活性物質(zhì)、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)及細(xì)胞凋亡過程等方面的研究越來越深入?；诎l(fā)光材料開發(fā)出的可視化分析技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)分析。目前，用于生物成像分析的探針主要是基于有機(jī)染料分子的熒光成像，它們?yōu)榛罴?xì)胞分析提供了有效的成像檢測(cè)手段。但有機(jī)熒光染料分子存在著熒光壽命較短、容易淬滅及發(fā)光強(qiáng)度不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。如何設(shè)計(jì)出新型發(fā)光生物探針以提高生物成像分析的選擇性和準(zhǔn)確性，實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，是急需

2、解決的問題。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，由于量子點(diǎn)熒光探針發(fā)射峰窄，光穩(wěn)定性好，在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用潛力受到廣泛關(guān)注。但是，傳統(tǒng)的量子點(diǎn)多數(shù)由重金屬構(gòu)成，由此帶來的潛在生物毒性限制了其在生物成像領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用。而另一種不需要光源激發(fā)的發(fā)光技術(shù)，包含了生物發(fā)光在內(nèi)的化學(xué)發(fā)光，是一個(gè)多元的化學(xué)反應(yīng)體系，被廣泛的應(yīng)用于體液及組織提取液中的活性物質(zhì)檢測(cè)。但其不能無損的進(jìn)入細(xì)胞，且多元的反應(yīng)組分在生物體內(nèi)的擴(kuò)散速率差異也制約了化學(xué)發(fā)光技術(shù)在生物體內(nèi)成

3、像上的應(yīng)用。
　　為了解決上述問題，本論文基于兩種新型的納米材料，即MoS2量子點(diǎn)和包裹介孔二氧化硅殼層的聚離子液納米反應(yīng)器，開發(fā)出了具有細(xì)胞成像分析功能的新型熒光探針和化學(xué)發(fā)光探針。
　　本論文主要包括以下四個(gè)方面的內(nèi)容：
　　1、通過改進(jìn)的化學(xué)剝離方法，用Na在160℃，真空條件下插入到MoS2粉末的片層中，結(jié)合超聲處理制備了具有強(qiáng)熒光性質(zhì)的單片層MoS2量子點(diǎn)。應(yīng)用透射電子顯微鏡、激光動(dòng)態(tài)光散射粒徑儀及Zeta電

4、位儀、原子力顯微鏡、紫外可見吸收光譜、熒光分光光度計(jì)和X射線衍射儀等對(duì)所合成的MoS2量子點(diǎn)進(jìn)行了表征。所制得的MoS2量子點(diǎn)粒徑約為3.5nm，表面電荷為-20.2 mV，具有良好的水溶性，且熒光穩(wěn)定性好的特點(diǎn)。通過MTT法檢測(cè)了MoS2量子點(diǎn)的細(xì)胞毒性。發(fā)現(xiàn)MoS2量子點(diǎn)的生物相容性好的優(yōu)點(diǎn)。通過毛細(xì)管電泳儀分析MoS2量子點(diǎn)和含巰基氨基酸的相互作用，結(jié)果表明MoS2量子點(diǎn)可以和含巰基的化合物共價(jià)結(jié)合。通過熒光顯微鏡考察了MoS2量

5、子點(diǎn)對(duì)細(xì)胞的標(biāo)記。結(jié)果表明MoS2量子點(diǎn)能順利穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，且能通過與細(xì)胞內(nèi)巰基化合物的作用長(zhǎng)時(shí)間的保留在細(xì)胞中，能對(duì)細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的熒光成像。MoS2量子點(diǎn)為長(zhǎng)時(shí)間活細(xì)胞熒光成像示蹤分析和研究細(xì)胞的微結(jié)構(gòu)提供了有效的研究方法和手段。
　　2、由于 MoS2量子點(diǎn)具有尺寸小、生物相容性好、易于被巰基修飾的優(yōu)點(diǎn)。我們通過表面修飾的方法在MoS2量子點(diǎn)表面修飾上兩種具有pH響應(yīng)的熒光配體（LA-Flu和LA-RhB）。進(jìn)而開發(fā)

6、出了pH檢測(cè)范圍更廣的pH響應(yīng)比率熒光探針（dl-MoS2）。LA-Flu在酸性條件下熒光強(qiáng)度降低，堿性條件下熒光強(qiáng)度升高。而LA-RhB在酸性條件下熒光強(qiáng)度增加，在堿性條件下熒光強(qiáng)度降低。通過兩個(gè)配體熒光強(qiáng)度的比值可以反映出細(xì)胞內(nèi)的pH值。與單一波長(zhǎng)響應(yīng)的pH熒光探針相比，比率熒光探針有效排除了探針濃度因素帶來的誤差。大多數(shù)具有pH響應(yīng)的單波長(zhǎng)熒光探針，對(duì) pH響應(yīng)的范圍限制在探針 pKa±1的范圍內(nèi)。dl-MoS2通過兩個(gè)不同pKa

7、值的pH響應(yīng)熒光配體的熒光比率隨pH的變化，使dl-MoS2在整個(gè)細(xì)胞內(nèi)pH范圍內(nèi)（pH=4-8）具有線性響應(yīng)。同時(shí)可以通過MoS2量子點(diǎn)表面的配體比，有針對(duì)性的調(diào)節(jié)dl-MoS2對(duì)pH的響應(yīng)范圍。
　　3、在MoS2量子點(diǎn)表面修飾上線粒體靶向基團(tuán)三苯基膦和pH響應(yīng)的LA-RhB配體，開發(fā)出了線粒體靶向pH響應(yīng)比率熒光探針（mito-MoS2）。mito-MoS2中MoS2量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度不隨pH變化而變化，在比率熒光探針中作為熒

8、光參照。細(xì)胞器共定位實(shí)驗(yàn)顯示：mito-MoS2在線粒體上共定位的皮爾森相關(guān)系數(shù)為0.856，而在溶酶體上共定位的皮爾森相關(guān)系數(shù)僅為0.259。這些結(jié)果表明mito-MoS2能靶向的在線粒體內(nèi)富集。通過雙激發(fā)雙發(fā)射熒光檢測(cè)模式，利用 mito-MoS2檢測(cè)了 Hela細(xì)胞線粒體的pH值，并對(duì)Hela細(xì)胞在氧化應(yīng)激狀態(tài)下線粒體pH變化進(jìn)行了成像檢測(cè)，結(jié)果表明mito-MoS2探針可以對(duì)線粒體內(nèi)的pH進(jìn)行實(shí)時(shí)成像檢測(cè)，并且能夠可視化的檢測(cè)線

9、粒體的酸化過程。
　　4、利用包裹介孔二氧化硅的聚離子液納米反應(yīng)器，開發(fā)出了具有核殼結(jié)構(gòu)的過氧化氫化學(xué)發(fā)光生物探針（c-PIL@SiO2）。聚離子液核具有特殊的親疏水性，由親水的帶電離子液部分和疏水的長(zhǎng)烷烴鏈部分組成。其中疏水區(qū)用于裝載過氧化草酸酯和熒光染料。親水區(qū)則為生物質(zhì)環(huán)境中的過氧化氫提供了進(jìn)入納米反應(yīng)器核芯的通道。外層的介孔二氧化硅殼層為該化學(xué)發(fā)光探針提供了必要的機(jī)械穩(wěn)定性并維持其在生物體系中的分散性。c-PIL@SiO2

10、粒徑在100 nm左右，激光共聚焦細(xì)胞成像結(jié)果表明c-PIL@SiO2能在5 min內(nèi)順利進(jìn)入RAW264.7細(xì)胞。而過氧化草酸酯和熒光染料裝載進(jìn)納米反應(yīng)器后，化學(xué)發(fā)光動(dòng)力學(xué)發(fā)生了改變，化學(xué)發(fā)光時(shí)間得以延長(zhǎng)。這些特點(diǎn)使得在c-PIL@SiO2無損地進(jìn)入細(xì)胞后，能夠順利地檢測(cè)到雙氧水的化學(xué)發(fā)光信號(hào)。我們進(jìn)一步利用c-PIL@SiO2，通過小動(dòng)物成像系統(tǒng)對(duì)小鼠的關(guān)節(jié)炎模型進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了該納米反應(yīng)器在細(xì)胞和活體層面上的化學(xué)發(fā)光成像。PIL@